[實用新型]乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201220248643.4
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN202754998U
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 林希瑾;秦偉;胡守旺;姚銘鋒;謝佐福;周曉強
• 申請（專利權）人: 泰普生物科學（中國）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C40B40/06;C12R1/93
• 代理公司: 福州市鼓樓區博深專利代理事務所(普通合伙) 35214
• 代理人: 林志崢

技術領域

本實用新型涉及一種疾病病原體基因檢測技術，尤其涉及一種乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測試劑盒。

背景技術

目前國內外對于慢性乙型肝炎病毒(hepatitis?B?virus，HBV)感染患者的主流治療方案是抗病毒長期治療。HBV是一種突變率極高的病毒，自然突變率10^10-11點突變/天，在長期藥物治療特別是核苷類似物藥物如拉米夫定等選擇壓力下，HBV耐藥突變發生頻率高，臨床耐藥突變成為影響慢性乙肝治療效果的主要因素。

拉米夫定是治療慢性乙肝最常用的核苷類似物藥物，但研究發現隨著用藥時間的延長患者發生病毒耐藥變異的比例增高，第1、2、3、4年分別為14%、38%、49%和66%，從而限制其長期應用。部分病例在發生病毒耐藥變異后會出現病情加重，少數甚至發生肝功能失代償。因此用拉米夫定治療慢性HBV感染患者，要用多長療程，何時發生耐藥、需要停換藥物，這是臨床醫生考慮的難點。替比夫定和拉米夫定的耐藥位點相同，95%以上對拉米夫定和替比夫定的耐藥突變都發生在rtL180M和rtM204V/I位點，一小部分病人的耐藥突變發生在rtA181T/V位點，rtA181T/V位點與阿德福韋有交叉耐藥。

阿德福韋酯是治療慢性乙肝最常見的核酸類似物藥物，其治療乙型肝炎病毒e抗原（HbeAg）陽性患者的第1、2、3年耐藥發生率分別為0%、1.6%和3.1%；治療HBeAg陰性患者的第1、2、3年耐藥發生率分別為0%、3.0%和5.9%~11%。雖然總的耐藥發生率較拉米夫定降低不少，但其耐藥發生后造成的危害同樣非常嚴重。目前已證實阿德福韋耐藥相關的變異主要包括rtA181V/T和rtN236T。

拉米夫定耐藥患者如加用阿德福韋治療，可降低對阿德福韋的耐藥率。因此，對拉米夫定耐藥患者，目前傾向于采用拉米夫定和阿德福韋聯合治療。值得注意的是，拉米夫定和阿德福韋聯合治療有可能選擇出對拉米夫定和阿德福韋同時耐藥的HBV毒株。拉米夫定耐藥（rtM204I）的患者換用阿德福韋治療，在出現阿德福韋耐藥（rtN236T）后加用拉米夫定，雖然出現了HBV?DNA的下降，但是同時出現了拉米夫定和阿德福韋聯合耐藥株（rtL180M+rtM204V+rtA181V）。

1989年由Saiki等提出了反向斑點雜交（reverse?dot?blot，RDB）技術，該技術是在PCR技術的基礎上進行了一個實用性的改進。Saiki及其同事在檢測HLA時提出了一個有效的改進，該方法是將靶基因在PCR過程用放射性元素標記，然后與尼龍膜雜交，從而檢測靶基因的突變情況。這一方法可將多個靶基因在同一條件下進行檢測從而大大提高了檢測的效率。隨后，其它科學家證實了該方法可以區分單個堿基的突變，利用共價鍵的探針固定方法代替紫外交聯以及使用非放射性的生物素標記引物的方法，RDB技術的穩定性有了明顯的提高。目前Inogenetics的LiPA系列產品（通過CE認證）均是基于上述的原理。

從技術原理來說，RDB在本質上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)的一種，但它不同于一般所說的玻璃DNA芯片，其信號特異性強，簡便易行，技術要求低，儀器設備投入小，檢測結果用肉眼就可直接判斷，而無需購買昂貴的激光掃描儀，更符合中國目前的國情也更利于在基層醫院推廣。然而，目前RDB技術整個雜交過程的操作步驟比較多，操作時間也相對較長，成為大規模推廣應用的阻力。基于此需求，雖然已經有相應的自動化雜交儀出現，但自動化雜交儀的價格昂貴，并非普通的基層醫院可接受。而且，繁多的操作步驟，也對自動化儀器運行的穩定性提出了挑戰。

在生物學領域中所涉及的基因芯片技術，是一種同時將大量探針分子固定到固相支持物上，借助核酸分子雜交配對的特性對DNA樣品的效率信息進行高效的解讀和分析的方法。這類技術在對基因表達譜的分析、突變檢測、多態性分析、基因測序和基因組文庫作圖等方面有相關應用。

實用新型內容

本實用新型的目的是提供一種用于乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測的試劑盒。

本實用新型的技術方案為提供一種乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測試劑盒，由乙型肝炎病毒耐多藥基因檢測芯片和配套試劑盒組成，乙型肝炎病毒耐多藥基因檢測芯片由帶有正電荷的固相載體和檢測乙型肝炎病毒耐多藥基因的探針組成，探針以共價鍵方式偶聯在固相載體上。

優選的，上述配套試劑盒包括分開放置的DNA提取液，DNA濃縮液，A液、B液、C液、D液、E液、F液。

優選的，上述固相載體為玻片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。