[實(shí)用新型]一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測(cè)及測(cè)序試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201220164667.1
• 申請(qǐng)日: 2012-04-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN202519266U
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳建中;唐金海;馮繼鋒;馬蓉;王卓
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吳建中;唐金海;馮繼鋒;馬蓉;王卓
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京正理專(zhuān)利代理有限公司 11257
• 代理人: 張文祎

技術(shù)領(lǐng)域

本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)試劑盒，尤其是涉及一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測(cè)及測(cè)序試劑盒。

背景技術(shù)

腫瘤藥物5-Fu的合成和分解之間存在著精細(xì)的平衡機(jī)制，其中分解代謝占主導(dǎo)地位。二氫嘧啶脫氫酶(Dihydropyrimidine?Dehydrogenase，DPD)作為5-Fu分解過(guò)程的關(guān)鍵酶，其活性高低直接決定了5-Fu進(jìn)入合成代謝和產(chǎn)生核苷酸類(lèi)似物的量。藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，DPD活性缺乏可導(dǎo)致5-FU體內(nèi)清除受阻.半衰期顯著延長(zhǎng)，分解減弱而合成增加，導(dǎo)致5-Fu在血漿中濃度的升高，細(xì)胞毒性也相應(yīng)增強(qiáng)，從而引起毒副反應(yīng)的發(fā)生。

與DPD酶活性相關(guān)的突變?yōu)镈PD(IVS14+1G＞A)，它是最常見(jiàn)的DPD突變。該突變位于DPD第14號(hào)內(nèi)含子和外顯子結(jié)合處的恒定剪切位點(diǎn)，導(dǎo)致DPD?mRNA缺失165個(gè)堿基，使其編碼的581-635位含55個(gè)氨基酸的片段丟失。對(duì)常規(guī)劑量5-FU即導(dǎo)致嚴(yán)重骨髓和胃腸道不良反應(yīng)的患者進(jìn)行DPD酶基因分析發(fā)現(xiàn)，DPD(IVS14+1G＞A)(14號(hào)外顯子處G-A突變，導(dǎo)致外顯子14處1個(gè)165bp片段的丟失)是DPD活性被抑制從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性的根本原因。DPD外顯子14缺失突變的攜帶者，在使用5-Fu治療時(shí)，發(fā)生嚴(yán)重毒副反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的10倍。

因此，DPD(IVS14+1G＞A)點(diǎn)突變檢測(cè)對(duì)于臨床腫瘤病人的個(gè)體化用藥及腫瘤發(fā)病機(jī)制研究至關(guān)重要。但目前臨床檢測(cè)的試劑原料需多方配備，實(shí)驗(yàn)過(guò)程分步進(jìn)行，耗時(shí)較長(zhǎng)，容易污染，結(jié)果不可靠，所以探索一種檢測(cè)DPD(IVS14+1G＞A)點(diǎn)突變快速可靠的方法已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

實(shí)用新型內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本實(shí)用新型提供一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測(cè)及測(cè)序試劑盒，包括盒體1、盒蓋2、固定座3、上游引物TCCTCTGCAAAAATGTGAGAAGGGACC試劑瓶4、下游引物TCACCAACTTATGCCAATTCTC試劑瓶5、酶混合物試劑瓶6、去離子水試劑瓶7，Bigdye3.1試劑瓶8、5×測(cè)序緩沖液(5×sequencing?buffer)試劑瓶9。固定座3上設(shè)置有PCR管10、測(cè)序管11、加樣器吸頭12。所述盒蓋2采用抽拉的方式實(shí)現(xiàn)開(kāi)合的作用。所述固定座3還設(shè)置有孔13?？?3設(shè)置用來(lái)分別將PCR管10、測(cè)序管11、加樣器吸頭12固定，以防止遺撒?？?3的形狀依據(jù)不同PCR管10、測(cè)序管11、加樣器吸頭12的形狀和大小而設(shè)置。

所述引物濃度為5pmol/L。

所述酶混合物包括濃度為0.4mmol/L的dNTPs，4mmol/L的Mg²⁺，2xBuffer，1.25U/25μl的HsTaq。

本實(shí)用新型與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，具有如下積極有益的效果：

1、本試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理、使用方便、制造容易、檢測(cè)過(guò)程不易受污染；本試劑盒在檢測(cè)二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變時(shí)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。

2、本試劑盒可以同時(shí)進(jìn)行二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變及測(cè)序，步驟更省略，效率更高。

附圖說(shuō)明

圖1為本實(shí)用新型的整體結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。

如圖1所示，本實(shí)用新型的一個(gè)實(shí)施例為一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測(cè)及測(cè)序試劑盒，包括盒體1、盒蓋2、固定座3、上游引物TCCTCTGCAAAAATGTGAGAAGGGACC試劑瓶4、下游引物TCACCAACTTATGCCAATTCTC試劑瓶5、酶混合物試劑瓶6、去離子水試劑瓶7。固定座3上設(shè)置有PCR管10、測(cè)序管11、加樣器吸頭12。固定座3還設(shè)置有孔13?？?3設(shè)置用來(lái)分別將PCR管10、測(cè)序管11、加樣器吸頭12固定，以防止遺撒。孔13的形狀依據(jù)不同PCR管10、測(cè)序管11、加樣器吸頭12的形狀和大小而設(shè)置。

所述引物濃度為5umol/L。

所述酶混合物包括濃度為0.4mmol/L的dNTPs，4mmol/L的Mg²⁺，2xBuffer，1.25U/25μl的HsTaq。

操作方法：

1)取模板DNA

取病人全血1ml，常規(guī)提取DNA，取1ul?DNA作為模板。

2)反應(yīng)體系

將各反應(yīng)物質(zhì)按照如下反應(yīng)體系進(jìn)行配比：

3)反應(yīng)

將反應(yīng)體系中各物質(zhì)在中混合，按照如下程序反應(yīng)：

95℃?5min，1個(gè)循環(huán)