[發(fā)明專利]從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210598004.5
• 申請日: 2012-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN103060296A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王議鋒;劉翠珍;葛翠鳳;宋超龍
• 申請（專利權(quán)）人: 青島九龍生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/76
• 分類號(hào): C12N9/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及從動(dòng)物胰臟中分離胰蛋白酶的方法。

背景技術(shù)

胰蛋白酶Trypsin(Parenzyme)為蛋白酶的一種，EC3.4.21.4。在脊椎動(dòng)物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是作為酶的前體胰蛋白酶原而被合成的。作為胰液的成分而分泌，受腸激酶，或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。

糜胰蛋白酶與彈性蛋白酶在結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制方面也具有密切關(guān)系，但其特異性則完全不同。胰蛋白酶系自牛、羊或豬胰中提取的一種蛋白水解酶。中國藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定按干燥品計(jì)算，每1mg的效價(jià)不得少于2500單位。由牛、羊、豬胰臟提取而得的一種肽鏈內(nèi)切酶，只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。白色或米黃色結(jié)晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24000，pI10.5，最適pH值7.8～8.5左右。pH＞9.0不可逆失活。Ca²⁺對酶活性有穩(wěn)定作用；重金屬離子、有機(jī)磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制劑對其活性有強(qiáng)烈抑制。臨床用于抗炎消腫，工業(yè)上用于皮革制造、生絲處理、食品加工等。

胰蛋白酶為蛋白質(zhì)水解酶，能選擇地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，能消化溶解變性蛋質(zhì)，對未變性的蛋白質(zhì)無作用，因此，能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創(chuàng)面凈化，促進(jìn)肉芽組織新生，此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等。噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。還常用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)前對組織的處理。

胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca²⁺、Mg²⁺和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca²⁺、Mg²⁺的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。

用現(xiàn)有的方法提取胰蛋白酶是相當(dāng)困難的。2006年7月上海阿敏制藥有限公司公開了一種糜胰蛋白酶的制備方法(200610023582.0)，其采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析的產(chǎn)品工藝，得到糜胰蛋白酶。2011年1月馬忠仁等申請了一種提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682.X)，其采用了CaCl₂激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時(shí)加入飽和度的(NH₄)₂SO₄，使其生成硫酸鈣沉淀吸附糜胰蛋白酶，經(jīng)過洗脫、鹽析、超濾和凍干獲得白色的糜胰蛋白酶的凍干粉末。產(chǎn)品均為糜胰蛋白酶的混合物，沒有單純的提取胰蛋白酶。本發(fā)明降低了成本，且能將胰蛋白酶提取出來。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是從動(dòng)物的胰臟中提取胰蛋白酶，實(shí)現(xiàn)糜胰蛋白酶的分離。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：利用硫酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來，然后根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理，調(diào)節(jié)pH，硫酸銨分級(jí)鹽溶、鹽析將胰蛋白酶原等沉淀析出，包括如下步驟：

(1)提取工序：將新鮮的胰臟絞碎成胰漿，稱重。按每千克胰漿加入2～3L的0.1～0.2mol/L硫酸溶液，浸漬20～28小時(shí)，將浸漬物置濾袋過濾，濾干后棄去濾渣，留取濾液；

(2)鹽溶工序：浸漬液中加入硫酸銨，達(dá)到30～50％飽和度，靜置10～16小時(shí)，過濾，留取濾液；

(3)鹽析工序：濾液中加入硫酸銨，達(dá)到50～80％飽和度，靜置10～16小時(shí)，過濾，留取濾餅；

(4)每克濾餅加入2～5ml的水溶解，重復(fù)上述(2)、(3)操作；

(5)每克濾餅用1～3ml的水溶解，然后每克濾餅中加入0.1～1ml的飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至4.0～6.0；