[發(fā)明專利]合成和純化寡聚物的新方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210595846.5
• 申請日: 2012-10-30
• 公開（公告）號: CN103172681A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杰里米·拉基;艾米麗·馬林·勒普魯
• 申請（專利權(quán)）人: 安捷倫科技有限公司
• 主分類號: C07H1/00
• 分類號: C07H1/00;C07H1/06;C07H21/04;C07H21/02
• 代理公司: 北京東方億思知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司 11258
• 代理人: 李劍

發(fā)明背景

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及寡核苷酸的試劑、合成和純化領(lǐng)域。

背景技術(shù)

寡核苷酸是短鏈核酸聚合物，典型地含有幾個至幾百個核苷酸。它們是基因組研究和生物技術(shù)的重要工具。雖然寡核苷酸可以通過較長前體的分裂產(chǎn)生，但是現(xiàn)在它們更通常是由單體以序列特異性的方式合成。它們典型地是在固體載體上使用亞磷酰胺化學或磷酸酯化學合成。

圖1A顯示了一個使用亞磷酰胺的固相寡核苷酸合成的典型合成循環(huán)。四個主要步驟包括：1)脫三苯甲基化；2)偶聯(lián)；3)封端；和4)氧化。如圖1中所示，第一核苷酸被化學鍵合到固體載體(例如，可控孔度玻璃珠(controlled?pore?glass?bead))上。這些可以以預(yù)鍵合到固體載體上的第一核苷酸的形式從商業(yè)來源購買。

要啟動合成，使用溫和的酸(例如，惰性溶劑如二氯甲烷或甲苯中2％或3％的三氯乙酸)將第一核苷酸的5′-羥基的保護基團(常用的5′-羥基的保護基團是三苯甲基(即，-C(Ph)₃)或4，4′-二甲氧基三苯甲基，其可以縮寫為DMT，DMTr)除去。然后，將具有3’-亞磷酰胺基團(例如，3′-O-(2-氰乙基-N-N-二異丙基)亞磷酰胺)的5′-DMTr保護的第二核苷酸偶聯(lián)到固體載體上的第一核苷酸上游離的5′-羥基基團上。該偶聯(lián)可以通過使用酸性唑催化劑(例如，1H-四唑)在乙腈中活化亞磷酰胺而實現(xiàn)。然后將活化的亞磷酰胺與游離的5′-羥基反應(yīng)，以形成亞磷酸三酯鏈接(linkage)。

因為偶聯(lián)反應(yīng)的效率永遠不會是100％，所以一些游離的5′-羥基將會保留。使用乙酸酐和?；呋瘎?例如N-甲基咪唑)將任何未反應(yīng)的5′-羥基封端，以防止失敗序列(failure?sequence)在下一個循環(huán)中反應(yīng)。封端之后，將亞磷酸三酯氧化，從而將它轉(zhuǎn)化成磷酸酯鏈接。氧化可以用碘在弱堿(例如吡啶)的存在下完成。這些步驟完成了第一偶聯(lián)循環(huán)。所述方法可以重復(fù)多個循環(huán)直到合成了期望的寡核苷酸。

類似的方法在圖1B中示出，其使用了H-膦酸酯單體代替亞磷酰胺。除了僅需要一個氧化步驟并且是在合成結(jié)束時進行之外，大部分步驟是類似的。

在鏈延長完成時，寡核苷酸仍附著在固體載體上并且完全被保護。為了提供功能性的寡核苷酸，需要除去保護基團并且需要將寡核苷酸產(chǎn)物從固體載體上釋放。這些可以使用堿溶液(例如氫氧化銨或甲胺水溶液)以及可能的其它預(yù)處理步驟(例如2-氰乙基保護基團的脫保護)完成。

上述合成步驟可用于DNA或RNA寡聚物的合成。然而，對于RNA的合成，2’-羥基需要用耐受反應(yīng)條件的基團進行保護。典型的2’-羥基的保護基團包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和三異丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)。

通常，偶和步驟不會100％完成。未完成的反應(yīng)導(dǎo)致短鏈體(short-mer)的形成。如上提到的，短鏈體典型地使用試劑例如乙酸酐進行封端，以防止它們在反復(fù)的固相合成中生長。這通常導(dǎo)致產(chǎn)生寡聚物池，所述寡聚物池由短鏈體(n-1、n-2、n-3等聚體)和期望的全長產(chǎn)物組成。圖2的(A)和(B)分別顯示了HPLC色譜和PAGE分析，以證明產(chǎn)物是含有一些失敗序列的混合物的事實。

來自寡核苷酸合成的產(chǎn)物總是含有失敗序列(較短的寡核苷酸，大部分是n-1聚體)。傳統(tǒng)上使用HPLC或硅膠電泳例如PAGE純化這些粗產(chǎn)物。雖然這些方法對于純化短寡核苷酸是可以接受的，但是對于純化較長的寡核苷酸(例如50-300聚體)卻是不能接受的。另外，這些方法可能是昂貴并且耗時的，可能消耗大量的溶劑并且可能僅限于熟練的的專業(yè)人員使用。