[發(fā)明專利]山梨木糖假絲酵母及其在制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210594514.5
• 申請(qǐng)日: 2012-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN103074239A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭裕國(guó);孫麗慧;舒學(xué)香;柳志強(qiáng);沈寅初
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/16
• 分類號(hào): C12N1/16;C12P7/62;C12R1/72
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新的菌株——山梨木糖假絲酵母ZJB-12164（Candida?sorboxylosa?ZJB-12164），及其在生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯合成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。

（二）背景技術(shù)

(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(Ethyl?(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate,?(S)-CHBE)?是一種無色透明油狀液體，分子式為C₆H₁₁ClO₃，分子量166.6，相對(duì)密度1.19g/mL，沸點(diǎn)93-95℃/5mmHg，(S)-CHBE結(jié)構(gòu)如式（Ⅰ）所示。(S)-CHBE作為重要的手性藥物中間體，可用于合成他汀類藥物—羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑，其制劑立普妥（阿托伐他汀鈣）是美國(guó)第一個(gè)年銷量超過一百億美元的藥物，目前也是全球最高銷量的藥物。另外，(S)-CHBE還可以轉(zhuǎn)化生成1，4-二氫吡啶類β-阻滯劑。因此，制備光學(xué)活性(S)-CHBE備受研究者的關(guān)注。

?(S)-CHBE的制備方法可以分為外消旋體拆分法和不對(duì)稱催化合成法。由于外消旋體拆分的方法制備效率不高，理論收率僅為50％，且產(chǎn)物的分離純化困難，因此，對(duì)于外消旋體的手性拆分制備(S)-?CHBE意義不大。與拆分法相比較而言，采用不對(duì)稱合成(S)-CHBE受到了更多的關(guān)注。以潛手性底物4-氯乙酰乙酸乙酯（Ethyl?4-chloroacetoacetate,?COBE）為原料，在一定條件下使其反應(yīng)生成(S)-CHBE過量，甚至全部為單一的對(duì)映體，從而避免和減少拆分過程。由于底物COBE價(jià)格便宜，很容易合成，因此不對(duì)稱合成法是最經(jīng)濟(jì)有效的合成(S)-CHBE方法。

以COBE為原料不對(duì)稱合成制備(S)-CHBE，可分為化學(xué)催化法和生物催化法兩類。化學(xué)催化法是采用手性的釕化合物（例如RuX₂[(S)-BINAP]）作為催化劑不對(duì)稱加氫還原，產(chǎn)物的e.e.值可達(dá)97%以上，但這種方法需要高壓加氫，對(duì)反應(yīng)器要求較高，而且所用催化劑價(jià)格昂貴，因此生產(chǎn)成本較高；而采用的生物催化劑既可以是提純的酶，也可以是微生物細(xì)胞。由于生物還原需要價(jià)格昂貴的輔酶參與，因此，通常采用具備輔酶再生系統(tǒng)的微生物全細(xì)胞作為催化劑。微生物法羰基不對(duì)稱還原制備(S)-CHBE具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物單一，立體選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，代表著綠色化學(xué)的發(fā)展方向。

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種新菌株—山梨木糖假絲酵母ZJB-12164（Candida?sorboxylosa?ZJB-12164），及其在羰基不對(duì)稱還原制備(S)-CHBE中的應(yīng)用，該菌株穩(wěn)定性好，立體選擇性嚴(yán)格，產(chǎn)物光學(xué)純度高。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明涉及一種山梨木糖假絲酵母ZJB-12164（Candida?sorboxylosa?ZJB-12164），保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)CCTCC?No：M?2012420，保藏日期2012年10月22日。

本發(fā)明所述的山梨木糖假絲酵母ZJB-12164是通過以下程序篩選得到的：

(1)?將來自于浙江、四川、云南和江蘇等地200余份土壤樣品加入到生理鹽水中，制成土壤懸液并接種于富集培養(yǎng)基中，在30℃，150r/min的搖床上培養(yǎng)直至培養(yǎng)液變渾濁后，按2%（v/v）接種量轉(zhuǎn)接到新的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。富集培養(yǎng)基配方為：葡萄糖50g/L，黃豆芽100g/L，COBE?12g/L，溶劑為水，自然pH。

(2)?第二次富集培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)后保藏，斜面培養(yǎng)條件為30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48小時(shí)。平板培養(yǎng)基及斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖50g/L，黃豆芽100g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，自然pH。