[發明專利]節桿菌ZJB-09277及其在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用

有效

• 申請號: 201210594042.3
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103114054A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 鄭裕國;鄭仁朝;李愛朋;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/00;C12R1/06
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

（一）技術領域

本發明涉及一種新的菌種——節桿菌ZJB-09277(Arthrobacter?sp.?ZJB-09277)，及利用該微生物選擇性拆分3-氰基-5-甲基己酸酯制備普瑞巴林中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。?

（二）背景技術

(S)-3-氰基-5-甲基己酸是合成普瑞巴林的重要手性中間體。普瑞巴林，化學名為(S)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，是由美國輝瑞公司開發的的γ-氨基丁酸的3位異丁基取代物(Angew?Chem?Int?Ed，2008,?47(19):?3500-3504)。由于普瑞巴林能夠有效抑制與神經病理性疼痛、癲癇相關的神經元過度興奮及神經遞質釋放增加(Curr?Opin?Pharmacol，2006,?6(1):?108-113)，已被FDA批準用于帶狀皰疹后神經痛、糖尿病外周神經痛、癲癇、纖維肌痛等。與傳統藥物相比，普瑞巴林的劑量更低、服用次數少、副作用小、持續時間長、耐受性強(Curr?Med?Res?Opin，?2006,?22(2):?375-384)，因此被國際疼痛學會(IASP)、歐洲神經病學學會聯盟(EFNS)和英國NICE等多個國際指南推薦為一線治療藥物，國內外市場前景十分廣闊。?

國內外報道了大量有關普瑞巴林及其中間體合成工藝的文獻，可歸為手性拆分法、不對稱催化法、手性配體法和手性化合物直接合成法等四大類化學合成工藝。由于上述工藝步驟冗長、手性拆分試劑昂貴、反應條件苛刻、有毒有害溶劑用量大，而無法實現規模化生產。生物催化法由于反應條件溫和、立體選擇性高、環境友好等優點成為最受矚目的醫藥及精細化學品合成技術之一。目前，已報道的生物催化合成普瑞巴林手性中間體工藝主要有以下幾種：?

Xie等(Journal?of?Molecular?Catalysis?B:?Enzymatic,?2006,?41:?75–80)以?從Arabidopsis?thaliana中克隆得到的重組腈水解酶?AtNit1為催化劑拆分外消旋異丁基丁二腈合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸，ee值高達98%，(S)-3-氰基-5-甲基己酸催化加氫，制得普瑞巴林。Felluga等(Tetrahedron:?Asymmetry,?2008,?19(8):?945-955)報道了以異戊醛為原料，在t-BuOK存在條件下與Witting試劑反應，得到α,β-不飽和酸酯。α,β-不飽和酸酯與硝基甲烷發生Michael加成得到外消旋β-異丁基-γ-硝基酯，經Novozyme?435動力學拆分得到S型β-異丁基-γ-硝基酸，最后在酸性環境中氫化還原得到普瑞巴林。Sterimbaum等利用Candida?antartica脂肪酶CALB?(Candida?antarctic?lipase?B)選擇性酯化3-異丁基戊二酸，產物ee為95.5%，再通過化學反應得到普瑞巴林(WO2009158343-A1)。Thijs等在拆分步驟引入豬肝臟酯酶對吡咯酮化合物進行動力學拆分，ee值達到?97%，最后在酸性條件下水解2-吡咯酮得到普瑞巴林(WO2009149928-A1)。輝瑞公司普瑞巴林生產工藝已經更新至第二代，該工藝引入脂肪酶Lipolase催化拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。該手性中間體經脫羧、堿性水解、氫化等步驟制得普瑞巴林(US20050283023)。?

（三）發明內容

本發明目的是提供一株可用于制備光學純(S)-3-氰基-5-甲基己酸的新菌種——節桿菌ZJB-09277(Arthrobacter?sp.?ZJB-09277)。其次提供該新微生物在選擇性拆分外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用。?

本發明采用的技術方案是：?

本發明涉及一種節桿菌ZJB-09277(Arthrobacter?sp.?ZJB-09277)，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國?武漢?武漢大學，保藏編號CCTCC?NO:?M?2012419，保藏日期2012年10月22日。?

該新菌株特征如下：?

菌落形態：30?oC在牛肉膏蛋白胨平板培養24?h，菌落呈圓形，直徑2~3?mm，隆起形狀為凸鏡狀，乳白色，邊緣整齊，光滑。菌落隨時間的延長而增大，數天后直徑可達5?mm以上。?

細胞形態：16?h培養物的細胞呈不規則的桿狀，0.8~1.2?μm×1.8~8.0?μm。呈V形排列，端圓，無絲狀體，無芽孢形成。培養時間延長，細胞逐漸變短，老培養物變成球狀。?