[發明專利]一種重組豬干擾素γ及其編碼基因和表達方法

有效

• 申請號: 201210593705.X
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103059124A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 馬永;王安良;章成昌;徐春林;陳晨;王耀方
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司;常州京森生物醫藥研究所有限公司
• 主分類號: C07K14/57
• 分類號: C07K14/57;C12N15/23;C12N15/63;C12N1/21;C12P21/02;C07K1/14;A61K38/21;A61P31/14;A61P31/16;C12R1/19
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1.一種重組豬干擾素γ，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

2.一種編碼權利要求1中所述的重組豬干擾素γ的基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。

3.一種載體，所述載體具有權利要求2的基因。

4.如權利要求3所述的載體，所述載體為pET21b。

5.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌具有權利要求3的載體。

6.如權利要求5所述的大腸桿菌，所述大腸桿菌為BL21（DE3）菌株。

7.一種重組豬干擾素γ的表達方法，包括如下步驟：

（1）挑取一個含有權利要求5或6中所述的大腸桿菌菌落，接入含抗生素的LB培養液，培養過夜；

（2）取過夜培養物轉接入于含抗生素的新鮮LB培養液中，震蕩培養至對數中期A₆₀₀=1.0；

（3）在培養物中加入濃度為0.5-1.5mmol/L的IPTG，37℃，誘導表達1-4小時后，離心處理收集含有重組豬干擾素γ的大腸桿菌菌體沉淀。

8.一種重組豬干擾素γ的純化和復性方法，其特征在于，包含如下步驟：

（1）將權利要求7中所述的含有重組豬干擾素γ的大腸桿菌菌體沉淀，用預冷的PBS重懸，于4℃，以12000rpm/min離心15min，重復一次；

（2）吸去上清，按每克（菌體濕重）加入3-10mL裂解緩沖液BufferA，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起；

（3）每克（菌體濕重）菌體加入3-10μL濃度為100mmol/L的PMSF，3-100μL濃度為100mg/mL的溶菌酶，冰上攪動20min；

（4）破碎菌體細胞，4℃，12000rpm/min離心，棄上清。

（5）包涵體沉淀用洗滌緩沖液Buffer?B洗滌，4℃，12000rpm/min離心15min，棄上清。包涵體沉淀重復本步驟一次；

（6）包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer?C溶解，室溫攪拌30-60min；

（7）充分混勻后室溫條件下12000rpm/min離心15min，棄沉淀，取上清，即得到重組豬干擾素γ變性溶液；

（8）用變性緩沖液Buffer?C將重組豬干擾素γ變性溶液的濃度稀釋至0.2mg/mL，4℃透析復性24小時，期間每6小時更換一次緩沖液Buffer?D，重組豬干擾素γ復性溶液經濾膜過濾后，即得到重組豬干擾素γ復性溶液。

9.如權利要求8所述的純化和復性方法，其特征在于，所述重組豬干擾素γ復性溶液可進一步用截留分子量10KDa的超濾濃縮、脫鹽至最小體積，低溫真空干燥，即獲得重組豬干擾素γ粉末。

10.一種藥物組合物，其特征在于：所述藥物組合物包含由權利要求8或9的方法得到的重組豬干擾素γ。