[發(fā)明專利]一種誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210593429.7
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103045529A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 何自福;藍國兵;羅方芳;佘小漫
• 申請（專利權）人: 廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;蘇運貞

技術領域

本發(fā)明屬于植物保護技術領域，涉及一種誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法。

背景技術

煙草疫霉（Phytophthora?nicotianae?Breda?de?Haan）是引起絲瓜疫病的病原菌，在絲瓜生產中為害嚴重。在氣候適宜的條件下，疫病短期即可暴發(fā)流行，造成很大的經濟損失。因此，常需要獲得大量無污染的煙草疫霉菌的孢子囊或游動孢子，用于監(jiān)測各地煙草疫霉菌的致病力、測定各種殺菌劑對其孢子囊和游動孢子的生物學活性，以及測定絲瓜品種的抗性水平等。目前，室內獲得大量煙草疫霉菌孢子囊和游動孢子的方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)誘導法和新鮮寄主植物材料誘導法2種。

傳統(tǒng)培養(yǎng)誘導法：將菌絲置于燕麥培養(yǎng)基或黑麥培養(yǎng)基或V8汁培養(yǎng)液，活化培養(yǎng)較長一段時間后，再加入土壤浸出液或者皮氏液，光照條件下誘導產生孢子囊，經低溫處理后產生游動孢子。該方法誘導疫霉菌產生孢子囊需要10天以上，時間長。

新鮮寄主植物材料誘導法：將活化好的疫霉菌接種到新鮮寄主植物的子葉或果實中，培養(yǎng)一段時間后即可誘導產生孢子囊，經低溫處理后產生游動孢子。該方法所需要的時間較短，但容易遭受細菌的污染，而且植物材料較難獲得。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種簡便、快速誘導煙草疫霉菌產生大量無污染的孢子囊并釋放游動孢子的方法，用于煙草疫霉菌致病力測定、殺菌劑對煙草疫霉菌的生物活性測定以及絲瓜品種對疫病的抗病性鑒定等研究。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法，包括如下步驟：

（1）煙草疫霉菌活化：將煙草疫霉菌接種于PDA培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)。

（2）制備產生孢子囊的誘導液：用水將市場上購買的貝奇（福建）食品有限公司生產的貝奇野菜復合蔬果汁飲料配制成體積濃度15%～25%的貝奇野菜復合蔬果汁液，滅菌后備用；制備質量濃度為0.05%～0.2%的復合肥溶液，滅菌后備用。

（3）誘導產生孢子囊：取步驟（1）已活化的煙草疫霉菌接種到步驟（2）制備的體積濃度15%～25%的貝奇野菜復合蔬果汁液中，25℃～30℃黑暗培養(yǎng)2d～4d；然后倒盡貝奇復合蔬果汁液，換上步驟（2）制備的質量濃度為0.05%～0.20%的復合肥溶液，于光照強度500Lux～700Lux的白色日光燈下25℃～30℃連續(xù)光照培養(yǎng)2d～4d，即可誘導產生孢子囊。

（4）誘導釋放游動孢子：將步驟（3）經過誘導的煙草疫霉菌4℃～10℃放置20min～40min，然后置于25℃～30℃，30min后即可釋放出大量的游動孢子。

步驟（1）中所述的活化培養(yǎng)為25℃～30℃黑暗培養(yǎng)2d～4d；更優(yōu)選的所述的活化培養(yǎng)的溫度為27℃。

步驟（2）中所述的水優(yōu)選為雙蒸水。

步驟（2）中所述的貝奇野菜復合蔬果汁的體積濃度優(yōu)選為20%。

步驟（2）所述的復合肥優(yōu)選為硫酸鉀型15-15-15復合肥，所述的復合肥溶液的質量濃度優(yōu)選為0.1%。

步驟（2）中所述的滅菌的條件優(yōu)選為121℃濕熱滅菌25min。

步驟（3）中所述的誘導產生孢子囊的方法優(yōu)選為：取步驟（1）已活化的煙草疫霉菌邊緣菌絲塊置于無菌的培養(yǎng)皿上，加入步驟（2）制備的體積濃度20%的貝奇野菜復合蔬果汁液，使果汁液剛好浸過菌絲塊，27℃黑暗培養(yǎng)2d；然后傾盡貝奇野菜復合蔬果汁液，換上步驟（2）制備的復合肥溶液，使復合肥溶液也剛好浸過菌絲塊，置于光照強度600Lux的白色日光燈光照培養(yǎng)箱中27℃連續(xù)光照培養(yǎng)3d，即可誘導產生大量的孢子囊。

步驟（4）中所述的誘導釋放游動孢子的方法優(yōu)選為：將步驟（3）經過誘導的煙草疫霉菌4℃放置30min，然后置于27℃，30min后即可釋放出大量的游動孢子。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：

（1）快速：本發(fā)明的方法可以在5d內獲得大量的煙草疫霉菌的孢子囊和游動孢子，較傳統(tǒng)培養(yǎng)誘導方法相比，誘導周期可以縮短一半；與新鮮寄主植物材料誘導法的誘導周期相當。

（2）無污染：本發(fā)明的誘導液經過滅菌處理，在操作過程中亦無污染源的加入，誘導出的孢子囊和游動孢子均沒有污染。

（3）誘導液可以長期保存?zhèn)溆茫罕景l(fā)明的誘導液經過滅菌處理，可置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫缬行枰纯赡贸鰜硎褂谩?/p>

附圖說明

圖1是誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子流程圖。