[發明專利]一種制備高純度β-聚蘋果酸的方法

在審

• 申請號: 201210592448.8
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103103225A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 喬長晟;姜少麗;馬正旺;李政;李振海;鐘海蛟
• 申請（專利權）人: 天津北洋百川生物技術有限公司
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C08G63/90;C12R1/645
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技術領域

本發明屬于高分子聚合物制備領域，本發明涉及一種制備β-聚蘋果酸的方法，特別是涉及一種制備高純度β-聚蘋果酸的方法。

背景技術

β-聚蘋果酸（β-PMLA）是一種以蘋果酸為單體的高分子聚合物，因其具有良好的水溶性、可化學衍生性、可降解性、可再生性、生物安全性等特點而受到研究者的重視。可期待在化妝品、藥物、包裝材料等領域廣泛應用。

聚蘋果酸的生產主要有化學合成法和微生物發酵法兩種，化學合成的方法較多，主要分為直接聚合法、交酯開環法和內酯開環法，可分別得到γ型、α型和β型，由于在生物體內天然存在的是β型PMLA,故開發β型PMLA的合成方法便成為研究的熱點。而化學法合成β－PMLA，只有內酯開環法一種，該方法形成內酯的步驟較多、產率低、反應溫度高、中間產物分離提純繁瑣，制約了該方法的發展。

1969年，Shimada等發現一種由蘋果酸組成的高分子化合物能夠抑制圓弧青霉的酸性蛋白，后來被證實為聚蘋果酸。到目前為止，國內外專家已經對聚蘋果酸的生物發酵法進行了深入的研究，并獲得了高產量的菌株及其生產工藝。但對生物發酵生產聚蘋果酸的提取工藝的研究尚不是太多，國內外的論文和專利也很少，大多數專利和論文著重介紹的都是聚蘋果酸菌株的培養方法，及簡單的提取方法，例如：1995年公開的日本專利“生產蘋果酸聚合微生物的培養方法（JP7308188A2）”、1992年公開的日本專利“微生物合成L-蘋果酸聚合物（JP42111385A2）”。中國專利“同時獲得副產物普魯蘭多糖的β-聚蘋果酸的制備方法（公開號為CN101100687A）”中，介紹的方法是同時獲得聚蘋果酸和普魯蘭多糖兩種產物，并除去里面的黑色素，但沒有具體提到通過這種方法得到的聚蘋果酸達到多少純度。“β-聚蘋果酸及其鹽的制備方法（公開號為CN101487034A）”中介紹了在發酵的同時，通過膜技術回流發酵液以分離高分子量的聚蘋果酸，并將低分子量的蘋果酸回流到發酵液中繼續發酵，并采用膜分離的方法對樣品做進一步的純化，通過這種方法可以得到高分子量的聚蘋果酸，但沒有說得到的聚蘋果酸的純度，而且醫用的聚蘋果酸并不需要太高的分子量。而且這種方法操作復雜，可行性比較差，而且成本較高。

發明內容

本發明解決的技術問題是：

采用醇沉的方法將發酵液中的大部分普魯蘭多糖除去，使β-聚蘋果酸提升到一定濃度。采用普魯蘭酶將存在于樣品中的一些很難除去的多糖去除，采用離子交換的方法將β-聚蘋果酸鹽轉變為β-聚蘋果酸。凍干得到純度達80%以上的β-聚蘋果酸。

本發明解決技術問題時所采用的技術方案如下：

1、菌種活化

將甘油管保存的出芽短梗霉接種到活化培養基上，在23-25℃培養2-3d。

2、種子培養

將培養好的斜面種子，采用洗菌的方法接種到種子培養基中，25-28℃，150-200r/min條件下振蕩培養3d，制得種子液。

3、發酵培養

將2中得到的種子培養物以5%-10%的接種量，接種于發酵培養基中，25-28℃，150-200r/min條件下振蕩培養7-10d。

4、分離純化

a、普蘭多糖的去除：在發酵培養后，離心除去菌體，邊攪拌邊加入甲醇或乙醇，加入量占加入后總液體體積的25%，用玻璃棒攪拌，玻璃棒上纏繞的絮狀物即為普魯蘭多糖，將其移除；

b、聚蘋果酸粗品的提取：向a得到的液體中邊攪拌邊繼續添加甲醇，使甲醇的總含量達到總液體體積的60%，將上清液移除，向沉淀中再加入甲醇洗滌沉淀1-3次；離心后將沉淀收集，冷凍干燥得白色樣品；

c、樣品中難分離多糖的去除：將b中得到的白色樣品再次溶解，加入2-10%（v/v）的普魯蘭酶，60℃反應30-60min，冷卻，加入甲醇，使甲醇的總含量達到總液體體積的60%，進行醇沉；離心收集沉淀物，冷凍干燥，即可得到純度為80%以上的β-聚蘋果酸鹽白色粉末；

d、將c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h過強酸性陽離子交換樹脂，得到含有β-聚蘋果酸的溶液，將其凍干即得到純度為80%以上的β-聚蘋果酸。

5、本發明技術方案中所用到的培養基為：

（1）活化培養基：即馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH6.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min；