[發(fā)明專利]來源于嗜堿菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210592342.8
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103060346A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田永生;許晶;彭日荷;金曉芬;韓洪娟;韓靜;王波;王麗娟
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/70;C12N15/82;A01H5/00;C12R1/01
• 代理公司: 上海開祺知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31114
• 代理人: 費(fèi)開逵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種按植物密碼子偏愛合成的來源于嗜堿菌（Alkaliphilusmetalliredigens）的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及應(yīng)用，特別具體涉及該5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的原核表達(dá)、純化及其在轉(zhuǎn)基因作物培育中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

草甘膦是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型優(yōu)秀除草劑，廣泛用于果園、膠園、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后處理，以及出苗后定向處理。1974年在美國注冊登記以來，至今已在世界100多個國家注冊，成為世界上使用面積最大的除草劑品種之一。但是該除草劑同樣是一種非選擇性除草劑，對農(nóng)作物同樣有著殺死作用。為了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用草甘膦，必須培育出具有草甘膦抗性或者降解性的農(nóng)作物。

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate）毒性作用機(jī)理是競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性。該合成酶是植物和微生物體內(nèi)芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）生物合成過程中的一個關(guān)鍵酶，該酶由aroA基因編碼。

目前種植抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的國家越來越多，面積也迅速增加，種植面積不斷擴(kuò)大，占全球種植轉(zhuǎn)基因作物的78%以上。根據(jù)2002年資料表明，耐草甘膦大豆依舊是美國、阿根廷、加拿大、墨西哥、羅馬尼亞、烏拉圭和南非等七國的主要商品化轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。耐草甘膦除草劑大豆在全球范圍內(nèi)種植3650萬公頃，占全球總轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積的62%。然而現(xiàn)在應(yīng)用于生產(chǎn)的抗草甘膦基因僅有兩個，且都受到專利的保護(hù)，因此發(fā)掘新型的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因?qū)τ谂嘤哂凶灾髦R產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物將是非常有必要的。

最近，來自于極端微生物體內(nèi)的好多酶都已成為研究的熱點(diǎn)，主要是因為微生物生長在極端環(huán)境中從而使這些酶可能具有潛在的特殊的生物功能。嗜堿菌（Alkaliphilusmetalliredigens）是一種革蘭氏陰性菌，該菌能夠在pH=8.0-11.0的堿性環(huán)境中生存。其全基因組測序已于2009年完成（NCBI?Reference?Sequence:NC_009633.1）在過去的幾年時間里，很多來自該堿性微生物中的酶被分離出來并進(jìn)行研究了。然而來自該菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶還從未研究過，也未見對該酶功能的研究報告。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來源于嗜堿菌（Alkaliphilusmetalliredigens）的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其應(yīng)用。

所述的來源于嗜堿菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ?IDNO?1所示，它是根據(jù)植物密碼偏愛通過化學(xué)合成方法得到的。即采用大量重疊的引物通過兩步PCR進(jìn)行全基因的合成（PTDS）（Nucleic?Acids?Research，2004，32：e98）。

具體合成方法包括以下步驟：

引物設(shè)計：設(shè)計長度大概為60bp左右的覆蓋整個5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的寡核苷酸的序列44個，其中每相鄰的兩個寡核苷酸序列有20個堿基的重復(fù)。

PCR擴(kuò)增：利用PCR進(jìn)行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶擴(kuò)增。其中，在100μl反應(yīng)體系中，P2~P43共42個引物的添加量為2ng，兩個外側(cè)引物P1和P44的添加量為30ng，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min，94℃30s，50℃30s，72℃10min，使用的Taq?DNA聚合酶為KOD?FXtaq酶（Toyobo公司，日本），共25個循環(huán)。

轉(zhuǎn)化：PCR結(jié)束后，用1%瓊脂糖膠回收片段，取10μl直接與T/A克隆載體相連（大連寶生物公司）。4℃連接過夜，在DH5α感受態(tài)中高效轉(zhuǎn)化，獲得長度為1293bp的SEQ?ID?No1序列的陽性克隆，即為本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，經(jīng)序列測定，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1所示。