[發(fā)明專利]來源于灰蓋鬼傘菌的漆酶2基因及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210592335.8
• 申請(qǐng)日: 2012-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN103045620A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田永生;許晶;彭日荷;金曉芬;韓洪娟;韓靜;王波;王麗娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N9/02;C12N15/81;C02F3/00
• 代理公司: 上海開祺知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31114
• 代理人: 費(fèi)開逵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬微生物基因工程領(lǐng)域，涉及一種來源于灰蓋鬼傘菌（Coprinopsis?cinereaokayama）的漆酶2基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

漆酶（EC1.10.3.2）是一種含銅的氧化還原酶，屬于氧化酶的藍(lán)銅家族（Eur?J?Biochem187:341-352）。漆酶的應(yīng)用范圍很廣，目前研究它的應(yīng)用主要集中在它降解各種化工染料(J?Ind?Microbiol?Biotechnol31:127-132)、芳香族類化合物（Microbial?Cell?Factories5:31）以及二酚、多酚類化合物（Process?Biochemistry45:507-513）的功能。除此之外，漆酶在不同的物種發(fā)揮不同的功能：在昆蟲中，它們參與甲殼的硬化；在植物中，參與細(xì)胞壁形成，還與木質(zhì)素化和去木質(zhì)素有關(guān)；在芽孢桿菌中，則是和抗紫外線的孢子組裝有關(guān)；在一些植物致病性真菌利用這類酶免除植物抗毒素和鞣酸的作用。眾所周知，漆酶給工業(yè)生產(chǎn)方面帶來了巨大的貢獻(xiàn)。大量的漆酶基因從植物（J?Chem?Soc43：472）、動(dòng)物（萬云洋，博士論文，武漢大學(xué)）和微生物（Microbiology148：4003–4014）中分離出來，進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，收集了很多微生物的全基因組的信息，其中編碼蛋白的序列都被注釋了。但是大部分的蛋白的生化功能和生理功能都是未知的。因此研究注釋蛋白的功能可以完善這些酶學(xué)，并運(yùn)用到工業(yè)應(yīng)用中去。

灰蓋鬼傘菌屬于層菌綱家族，是亞洲很受歡迎的藥用菌類。它的化學(xué)成分已經(jīng)研究的相當(dāng)透徹。雖然灰蓋鬼傘菌有8個(gè)漆酶基因，但是來自灰蓋鬼傘菌的漆酶2的生理生化特性研究和對(duì)染料的脫色效果的研究目前還沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來源于灰蓋鬼傘菌（Coprinopsis?cinereaokayama）的漆酶2基因及其應(yīng)用。即通過化學(xué)合成方法得到所述的漆酶2基因，并將其應(yīng)用于真核生物中進(jìn)行表達(dá)和純化，研究其生理生化特性和對(duì)甲基橙、結(jié)晶紫和孔雀石綠的脫色效果。

所述的漆酶2基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No1所示，它是根據(jù)畢氏酵母密碼子偏愛通過化學(xué)合成方法制得的。即采用大量重疊的引物通過兩步PCR進(jìn)行全基因的合成（PTDS）（Nucleic?Acids?Research,2004,32：e98）。該方法是通過重疊延伸獲得合成基因的片段，再通過最外側(cè)的引物將全長的基因擴(kuò)增得到。該方法的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)就是不需要對(duì)引物進(jìn)行磷酸化處理。而且通過高通量的DNA合成儀器，可以較為便利地獲得大量的引物。

所述的漆酶2基因，其具體合成方法如下：

1、根據(jù)畢氏酵母密碼子偏愛設(shè)計(jì)引物

設(shè)計(jì)長度大概為60mer左右的覆蓋整個(gè)漆酶2基因的寡核苷酸的序列50個(gè)，作為引物。利用PCR進(jìn)行漆酶2基因擴(kuò)增，在100μl反應(yīng)體系中，P2~P29共48個(gè)引物的添加量為2ng，外側(cè)引物P1和P50添加量為30ng，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，72℃10min，使用的Taq?DNA聚合酶為KOD?FX?taq酶（Toyobo公司，日本），共30個(gè)循環(huán)。

PCR結(jié)束后，1%瓊脂糖膠回收片段，取10μl直接與T/A克隆載體相連（大連寶生物公司）。4℃連接過夜，高效轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)中，獲得長度為1500bp的陽性克隆，即為本發(fā)明的漆酶2基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQID?No2所示。

將上述制得的漆酶2基因轉(zhuǎn)入真核生物細(xì)胞中。即將該漆酶2基因直接與真核表達(dá)載體pYM7909（Molecular?Biology?Report，2012Apr;39(4):3807-14）相連，經(jīng)過DH5α克隆過的環(huán)形質(zhì)粒單酶切使其線性化，取約1μl的線性DNA與80μl畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化，然后涂布于固體SD山梨醇培養(yǎng)基（20g/L瓊脂，20g/L葡萄糖，146g/L山梨醇，SD）上，28℃繼續(xù)培養(yǎng)3天后獲得白色菌落。挑取經(jīng)測(cè)活呈陽性的畢赤酵母進(jìn)行細(xì)胞外分泌表達(dá)純化，即獲得純化后的漆酶2基因蛋白。然后對(duì)其進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)特性分析和生理生化特性分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明合成的漆酶2基因是一類應(yīng)用非常廣泛的生物用酶，通過克隆，可以高效人工合成，通過對(duì)該基因真核表達(dá)和純化，可以將其應(yīng)用于染料脫色工業(yè)生產(chǎn)中。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的以pYM7909質(zhì)粒構(gòu)建DNA表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)示意圖。