[發明專利]基于DNA hairpin和RCA的核酸檢測方法

無效

• 申請號: 201210591068.2
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103014168A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 桑建明;王瑋
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京君尚知識產權代理事務所(普通合伙) 11200
• 代理人: 余長江

技術領域

本發明屬于生物分子檢測領域，具體涉及一種基于DNA?hairpin和滾環擴增(RCA)實現核酸分子快速、高靈敏檢測的方法。?

背景技術

滾環擴增(rolling?circle?amplification，RCA)是新近發展起來的一種恒溫核酸擴增方法。以環狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物(與部分環狀模板互補)，在特殊的DNA聚合酶(phi?29?DNA聚合酶)催化下將dNTPs轉變成單鏈DNA。其線性擴增倍數為10⁵，指數化擴增能力大于10⁹，實現對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分子，在核酸檢測中具有很大的應用價值和潛力。比如Juan?Hu等人(Juan?Hu，Chun-yang?Zhang；Sensitive?detection?of?nucleicacids?with?rolling?circle?amplification?and?surface-enhanced?raman?scatteringspectroscopy；Anal.Chem.2010，82，8991-8997)利用RCA實現了高靈敏度的核酸檢測，但是其中設計過多分子探針設計，存在兩步酶促反應，增加了檢測的復雜性和檢測成本。?

DNA?hairpin是指一段單鏈DNA分子末端局部互補配對形成的一種特定分子結構，分為莖部(hairpin)和環部(loop)兩個部分。DNA?hairpin的莖-環結構在某些特殊的情況下可以打開，比如當另一段單鏈DNA與環部互補配對結合后，其莖-環結構就會打開?；谶@種特性，多種核酸檢測方法被提出。比如Gwo-bin?Lee等人(Yi-chih?Su，et?al；Multiple?pathogen?detection?for?poultry?byultilizing?integrated?microfluidic?system；MicroTAS’2012)利用在DNA?hairpin的5’端和3’端分別修飾上熒光分子和熒光猝滅分子的方法來檢測病原體DNA。但是熒光分子和熒光猝滅分子修飾價格昂貴，作為分子檢測的成本過高，不利于檢測方法推廣使用。?

發明內容

本發明的目的在于利用DNA?hairpin的環部與特定單鏈DNA或RNA互補配?對結合后其莖部會打開，以及目標核酸分子的量不同，打開的莖-環結構就不同的特性，將DNA?hairpin的莖部堿基序列設計為滾環擴增的引物，以簡化滾環擴增用于核酸檢測的步驟，以實現簡單，低成本，高靈敏度的核酸檢測。?

為實現上述目的，本發明采用以下步驟：?

1)將DNA?hairpin修飾到固體載體上；?

2)加入環狀DNA、酶、BSA、擴增原料；?

3)加入待測目標核酸分子，進行滾環擴增；?

4)擴增后對目標核酸分子進行定量檢測。?

步驟1)中，所述固體載體包括納米顆粒。?

步驟1)中，所述DNA?hairpin，包括5’端連接分子修飾，環部，莖部。?

進一步地，所述5’端連接分子為生物素(biotin)，通過與固體載體表面鏈霉親和素(streptavidin)結合，將DNA?hairpin修飾固定到載體表面；?

進一步地，所述環部堿基設計成能與目標核酸分子互補配對的堿基；?

進一步地，所述莖部的3’端堿基設計成能與滾環擴增的環狀DNA互補配對的堿基，作為滾環擴增的引物；?

步驟2)中，所述環狀DNA為單鏈環狀DNA，為滾環擴增的模板。?

步驟2)中，所述酶為恒溫酶，包括phi?29?DNA聚合酶，RNA聚合酶。?

步驟2)中，當檢測的目標分子是單鏈DNA時，擴增原料為四種脫氧核糖核苷酸，當檢測的目標分子是RNA時，擴增的原料為四種核糖核苷酸。?

步驟3)中，所述目標核酸分子包括單鏈DNA或RNA。?

本發明的核酸檢測方法利用了DNA?hairpin結構的可逆性和RCA的快速，簡易性，提供了一種簡易、高靈敏度的核酸分子檢測方法，其優點和積極效果如下：?

a)利用DNA?hairpin作為RCA的檢測探針，簡化了用RCA檢測分子的流程，減少了酶等生物試劑的使用，降低了檢測成本；?

b)利用了DNA?hairpin結構的可逆性，同時保留了RCA用于核酸檢測高靈敏度等的優點；?

c)各種檢測原料包括DNA?hairpin，環狀DNA，酶，擴增原料等均可在市場上買到，適于廣泛推廣使用。?