[發(fā)明專利]同時鑒定轉甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的方法

有效

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• 申請日: 2012-12-29
• 公開（公告）號: CN103045744A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 姚斌;徐曉露;孟昆;楊培龍;羅會穎;王亞茹
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院飼料研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發(fā)明涉及轉基因植物檢測領域，具體涉及同時鑒定轉甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的方法。?

背景技術

除常規(guī)的抗蟲抗病轉基因品系外，隨著基因工程技術的發(fā)展，針對飼用的功能性轉基因作物新品種培育已成為研究熱點，如已經獲得安全認證的轉植酸酶基因玉米在綠色飼料生產中具有良好的應用前景。轉甘露聚糖酶基因、轉葡聚糖酶基因、轉木聚糖酶基因和轉半乳糖苷酶基因玉米是針對減少飼料中抗營養(yǎng)因子，提高飼喂動物營養(yǎng)性能開發(fā)的新型飼用功能性轉基因玉米品種，由于目標酶能夠在玉米籽粒中特異表達，因此作為原料進行飼料生產時可以減少微生物發(fā)酵來源酶制劑的添加過程，從而大量節(jié)約酶制劑的使用成本。?

轉基因生物及其產物使用的前提是保證其安全性，目前國內轉基因作物大量用于飼料生產，這些飼料飼喂的畜禽及產品的食物鏈終端是人，所以轉基因作物成分檢測是整個轉基因安全性評價體系中重要一環(huán)。PCR技術作為常規(guī)經典的分子生物學技術可以在分子水平上快速有效的檢測極少量樣品的目標成分。?

多重PCR(multiplex?PCR)，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。盡管多重PCR擁有較多的優(yōu)點，它也有許多不容忽視的缺點，包括多對引物之間的相互作用、低擴增效率，以及不同的模板對引物的影響。這些缺點抑制了多重PCR的應用。研究表明，對于成功進行多重PCR尤為重要的因素是：用于擴增不同基因的不同引物對設計、引物對之間的相對濃度、PCR緩沖液的濃度、延伸溫度、延伸時間、退火時間、退火溫度、PCR循環(huán)數(shù)、氯化鎂和dNTP濃度間的平衡等等。其中最重要的設計合理的引物，使其在多重PCR反應中，可以高效地擴增目的基因片段。?

隨著轉基因作物的快速發(fā)展，越來越多的研究已經利用多重PCR的方法快速、簡捷地進行轉基因作物的篩選。目前，已開發(fā)了利用多重PCR方法檢測轉基因大豆及玉米的方法（Forte,V.T.,et?al.,Food?Control,l6,535-539,2005;Germini,A.,et?al.,?Journal?of?Agricultural?and?Food?Chemistry,52,3275–3280,2004）。轉基因植物作為飼料，利用多重PCR反應可以進行飼料中多種基因同步鑒定，同時從飼料中擴增出目的條帶，通過減少反應次數(shù)，節(jié)省了時間、人力、和物力（Mafra,I.,et?al.,European?Food?Research?and?Technology,227,649–665,2008）。?

本發(fā)明以甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因序列設計特異引物并優(yōu)化PCR體系及條件，能從混合基因組模板中有效擴增目的基因片段，為今后飼用酶轉基因玉米原料成分的鑒定檢測提供方法。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的發(fā)明人為了克服上述問題提出并完成了本發(fā)明。?

因此，本發(fā)明的目的是提供同時鑒定轉甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的方法。?

本發(fā)明的再一目的是提供同時鑒定轉甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的試劑盒。?

本發(fā)明的另一目的是提供能夠同時鑒定轉甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的引物組合。?

根據本發(fā)明的同時鑒定轉甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的方法包括使用以下引物進行PCR擴增的步驟：?