[發明專利]一種磷酸肌酸鈉的制備方法

無效

• 申請號: 201210590973.6
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103014083A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 許崗;黃斌;吳峰;曾紅宇
• 申請（專利權）人: 湖南寶利士生物技術有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N15/70;C12N9/12;C12N11/08;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

1.一種制備磷酸肌酸鈉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）分別構建肌酸激酶和乙酸激酶表達菌株，誘導表達并進行破碎處理；

（2）采用特異性金屬螯合親和純化方法制備高純度的肌酸激酶和乙酸激酶；

（3）將肌酸激酶和乙酸激酶共固定至載體顆粒上，形成共固定化酶；

（4）共固定化酶催化反應生成磷酸肌酸鈉；

（5）離子交換樹脂分離純化磷酸肌酸鈉。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）為分別合成肌酸激酶基因和乙酸激酶基因，將肌酸激酶基因和乙酸激酶基因分別連至克隆載體上，轉化大腸桿菌，篩選得到正確的克隆載體，并分別構建含肌酸激酶基因和乙酸激酶基因的表達載體，然后分別將這兩種重組載體通過化學轉化或電轉化的方式轉入表達型大腸桿菌，構建表達型大腸桿菌重組菌，誘導表達并進行破碎處理；

其中，所述肌酸激酶基因是兔肌肉型、兔腦型、牛線粒體型、人雜化型或人線粒體型的肌酸激酶基因；

所述乙酸激酶基因是反芻月形單胞菌K6、埃氏巨型球菌、保加利亞乳桿菌或者Marinithermus?hydrothermalis?DSM14884的乙酸激酶基因；

所述克隆載體為pBluescript系列或pUC19；所述表達載體為pET22、pET28、pET15或pET43；

所述大腸桿菌為DH5α、Top10或JM109；所述表達型大腸桿菌為BL21（DE3）。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述肌酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述乙酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）為利用特異性金屬螯合親和層析柱純化破碎的大腸桿菌重組菌菌液，菌液以25-45BV/h的流速過柱，以30-50BV/h流速洗脫，洗脫液經除鹽處理后得到純化的肌酸激酶和乙酸激酶。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3）為將純化后的肌酸激酶、乙酸激酶與固定化載體顆粒按1000-5000U:1200-6800U:50-250g比例進行混合，進行固定化反應，固定化過程中加入硫酸銨固體粉末至終濃度250-350mM，固定化溫度為15-35℃，時間為10-50h，固定化過程中控制pH值為5.5-6.5。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述固定化載體顆粒為環氧型樹脂。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4）為配制共固定化酶催化反應的反應物溶液，所述反應物溶液中ATP濃度為10-50mM，肌酸濃度為ATP濃度的1-5倍，鎂離子濃度為ATP濃度的1-5倍，乙酰磷酸濃度為ATP濃度的1-5倍，加入緩沖體系使反應物溶液的pH值為8-10，再加入100-500g的共固定化酶顆粒，催化反應的溫度為25-45℃，反應過程中不斷滴入稀堿以維持pH在8.0-9.0，當反應溶液的pH值不再變化時停止反應，篩網過濾分離共固定化酶顆粒和反應后的溶液。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述緩沖體系為Gly-NaOH緩沖體系或Na₂B₄O₇-NaOH緩沖體系。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（5）為將離子交換樹脂填裝層析柱，步驟（4）反應后的溶液以6-10BV/h的流速過柱，以6-10BV/h的流速洗脫。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述樹脂為Amberlite?IRA900，D201，D301樹脂中的一種。