[發明專利]從嗜熱細菌中分離的編碼DNA聚合酶的DNA

無效

• 申請號: 201210590758.6
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103898131A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 龍虎;李春芳;狄廷娣;周裕程;萬強
• 申請（專利權）人: 思洛生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;C12N15/63;C12N15/70;C12N15/10;C12R1/01
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 李玉秋;郝鵬

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及從嗜熱細菌中分離的編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的DNA聚合酶，更具體的涉及從Thermococcus?gammatolerans分離得到的編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的DNA聚合酶。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction)，簡稱PCR，是一種在體外模擬體內核酸復制的分子生物學技術。其利用微量模板，在DNA聚合酶的作用下，沿引物的5'-3'方向不斷添加與模板互補的核苷酸，重復該循環過程，實現在1~3小時內將待擴增目的基因放大幾百萬倍的目的。該方法廣泛應用于核酸檢測、基因克隆、疾病診斷、分子標記育種等各個領域。影響PCR反應結果的主要因素，除模板和引物外，所使用的DNA聚合酶和反應體系直接決定了PCR是否成功以及結果的可靠性，DNA聚合酶本身的耐熱性、擴增效率、保真性、抗抑制劑等性能是評判其優劣的主要指標。在耐熱DNA聚合酶出現以前，PCR主要通過大腸桿菌DNA聚合酶或噬菌體DNA聚合酶來實現，由于PCR反應需要高溫變性、低溫退火的過程，其操作繁瑣、結果不穩定，直到從耐熱微生物Thermus?aquaticus?YT1中分離得到能耐受高溫變性的TaqDNA聚合酶（美國專利號：4,889,818），才使得該技術成為分子生物學的一種常用手段。但Taq?DNA聚合酶由于缺少3′-5'校正活性，其擴增過程中極易發生突變，且擴增特異性較差，嚴重影響下游實驗。后來從Pyrococcus?furiosus中分離出更耐熱且具有校正活性的Pfu?DNA聚合酶，其擴增突變率大大降低且特異性得到很大提高，擴增保真度是其他有校正活性DNA聚合酶的2-6倍；然而該酶效率低、擴增產物少、延伸時間長（1kb/2min），限制了其在很多實驗中的應用（美國專利號：5,545,552）。目前另一種DNA聚合酶KOD，來自鹿兒島縣小寶島的含硫氣孔中的超嗜熱原始菌Thermococcus?kodakaraensisKOD1，其具有極強的3’-5’外切酶活性、更快的延伸速度（1kb/30s），但由于其過強的外切活性，容易導致模板和引物的降解，產生非特異擴增且不適宜擴增長片段，通過突變減弱其外切活性又導致保真度極大的降低（美國專利號：6,033,859）。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種從嗜熱細菌中分離出的編碼DNA聚合酶的DNA，其編碼出的蛋白質即DNA聚合酶在PCR反應中具有較高的保真能力、較高的擴增效率以及耐高溫性能。

為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：

從嗜熱細菌中分離出的編碼DNA聚合酶的DNA，其具有如下序列之一：

（i）具有序列表中SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列；

（ii）在（i）限定的核苷酸序列中缺失、插入、替換一個或多個核苷酸。

本發明還提供一種DNA聚合酶，其具有如下氨基酸序列：

（i）具有序列表中SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列；

（ii）在（i）限定的氨基酸序列中缺失、插入、替換一個或多個氨基酸。

本發明的第三個目的是提供一種包含前述編碼DNA聚合酶的DNA的表達載體。

本發明的第四個目的是提供一種制備前述DNA聚合酶的方法，包括用包含前述編碼DNA聚合酶的DNA的表達載體轉化宿主細胞，培養轉化體，獲得DNA聚合酶。具體步驟如下：

（1）擴增如SEQ?ID?NO.1所述的基因片段，構建至含啟動子的表達載體；

（2）將表達載體轉化至宿主菌，得到能生產適用于PCR反應的DNA聚合酶的重組細胞；

（3）擴大培養該重組細胞，誘導后用于制備該DNA聚合酶；

（4）利用凝膠介質，例如鎳和肝素層析柱依次純化該DNA聚合酶。

本發明的第五個目的是提供一種前述的DNA聚合酶在核酸擴增中的應用。

本發明的第六個目的是提供一種PCR擴增試劑盒，其包含有前述的DNA聚合酶。

另外，本發明還提供一種含有前述的DNA聚合酶的PCR反應體系，具體包括有：

（1）反應的緩沖環境，包含Tris-HCl，pH7.4-8.8;

（2）反應體系中的K⁺離子濃度：1-30mMKCl；