[發明專利]一種小麥葉片氣孔保衛細胞觀察樣品的制備方法

無效

• 申請號: 201210589924.0
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103076217A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 趙林姝;劉錄祥;古佳玉;郭會君;李軍輝;謝永盾;趙世榮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明涉及植物研究技術，特別是一種小麥葉片氣孔保衛細胞觀察樣品的制備方法。

背景技術

小麥葉片氣孔是由兩個啞鈴狀的保衛細胞組成，研究表明，氣孔保衛細胞的長度可作為鑒定小麥植株染色體倍性的一個指標(王培等,1989)，并且根據水澆地及旱地條件下旗葉尖氣孔保衛細胞長度差值可初步判斷基因型的耐旱性(范光年等,1990,1991)。由于氣孔保衛細胞的觀察具有簡單、快速、成本低的特點，在染色體倍性及基因型耐旱性的間接鑒定中發揮著重要的作用。

小麥葉片氣孔保衛細胞觀察樣品的制備一般采用直接撕取法(劉沛和顧沛雯,1993)、刮制法(王培等,1989)、透明膠帶法粘取法(陳佰鴻等,2004;段云峰等,2008)及離析法(封濤和胡東,2008;師長海等,2010)。由于小麥葉片細長,直接撕取法往往將葉肉帶下,無法準確觀察；膠帶粘取法也存在表皮粘著葉肉的問題；鉻酸離析法將葉片中的葉肉破壞掉,再剝離表皮,在撕取過程中容易將表皮撕取的支離破碎；以上幾種方法都需要經過撕取葉片表皮的步驟,都存在表皮與葉肉難分離的問題,不易撕取成功,從而影響樣品觀察的效率。刮制法在刮制時刀片的刮制力度和角度不易掌握，會出現葉肉刮除不徹底的現象，從而影響樣品觀察的清晰度。這些方法在實際應用中都不同程度的存在不易操作、效率低等缺點，不適合大量樣品的制備觀察。

整體透明技術是植物學研究中常用的一種技術，常被用于觀察植物花粉粒、胚和子房(趙世緒等,1993;Van?baarlen等,2002;楊鷺生和李國平,2004;陳慶亮等,2005;Noyes等,2005)，其原理是植物組織或器官經過透明劑處理后，由于不同組織的厚度和折射率的不同，因此呈現出不同的狀態，透明處理后不需經過染色，利用明視野等顯微鏡即可進行組織結構觀察。常用的透明劑有強堿、冬青油、甘油、“4¹/2”復合透明劑、水合氯醛、二甲苯、氯仿、丁香油等(Herr,1971;郝建華和強盛,2007)。郝建華和強盛等[2007]利用甘油做為透明劑研究了番茄側根原基的發育，以冬青油為透明劑研究了菊科植物蘇門白酒草有性生殖過程；李彥坤等(2011)以懸鈴葉苧麻雌花為試驗材料研究了生殖過程中胚胎的發育，比較了不同固定液和透明液組合對透明效果的影響；趙志敬等(2010)利用強堿氫氧化鉀為透明劑，觀察了半夏葉表皮形態，獲得了較好的效果。但以目前已知的這些方案用于小麥葉片樣品中效果不好。

發明內容

本發明基于上述領域的空白，提供用于小麥葉片觀察樣品的整體透明技術，技術方案如下：

一種小麥葉片氣孔保衛細胞觀察樣品的制備方法，包括準備待處理材料，對待處理材料進行固定，脫水，整體透明三個步驟，其特征在于：所述整體透明采用的透明劑為：水合三氯乙醛、蒸餾水和甘油以重量比4g：1ml：0～0.5ml（這個比例可以合理擴大成范圍）的比例混合而得。

所述透明劑為水合三氯乙醛、蒸餾水和甘油以4g：1ml：0.5ml的比例混合而得。

所述固體采用無水乙醇與冰醋酸按6：1體積比的混合液。

透明的時間為6小時。

所述脫水指：用70％乙醇室溫浸泡固定后的待處理材料30分鐘，然后用無水乙醇室溫浸泡2次，每次30分鐘。

本發明首次將整體透明技術應用于小麥葉片氣孔保衛細胞觀察樣品的制備。并提供了能獲得較好效果的透明劑配方，飽和三氯乙醛、水合三氯乙醛和甘油混合液2種透明劑處理后，均獲得了清晰的顯微觀察圖像;加入甘油后對樣品具有保存作用，可以延長葉片樣品的保存時間，為樣品觀察提供方便。與對照相比,趙志敬等觀察半夏葉表皮形態采用的10%氫氧化鉀透明劑，在小麥葉片樣品制備中效果不好，利用10%氫氧化鉀處理小麥葉片后，葉片結構受到破壞，用鑷子夾取時極易使葉片破碎，顯微觀察時保衛細胞邊界不清晰，不利于準確測量保衛細胞長度。

本樣品制備技術只需對葉片進行固定、脫水、透明三個步驟即可在普通顯微鏡下觀察到清晰的葉表皮組織及氣孔器觀察圖像，免去了表皮撕取或葉肉刮制這一步驟，操作簡便易行，取材少，成本低，壓片清晰度高，氣孔真實性好，適用于小麥幼嫩和成熟葉片的氣孔觀察,為小麥花粉植株倍性鑒定研究中大量的、成批的氣孔保衛細胞觀察，提供了一種方便、快捷、高效的技術方法。

附圖說明

圖1?OlympusSZX16體式顯微鏡下不同處理后的小麥葉片