[發明專利]一種重組人血管內皮細胞生長因子A的制備方法

在審

• 申請號: 201210589088.6
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103898146A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 周曉雷;王曉婧;唐仁陶;齊磊;周青青;陳陽;張世光;張鋒;蓋文麗;謝濤;王莉芳;竇燕峰
• 申請（專利權）人: 石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明是利用基因工程技術制備蛋白的方法，尤其涉及利用基因工程技術制備重組人血管內皮細胞生長因子A的方法。

背景技術

血管內皮細胞生長因子（VEGF，Vascular?Endothelial?Growth?Factor），屬于VEGF-PDGF（Platelet-derived?growth?factor，血小板衍生生長因子?）超家族，由VEGF-A、B、C、D、E?和胎盤生長因子（PLGF）6?個成員組成，具有同源二聚體結構，在單體肽鏈上含有8個半胱氨酸殘基。其中VEGF-A是誘導腫瘤血管形成作用最強、特異性最高的血管生長因子。人VEGF-A基因全長?28kb，其位于染色體?6P21.3，編碼VEGF的cDNA長?14kb，由?8個外顯子和?7個內含子組成。VEGF-A經剪切后有?7種不同的單體，根據氨基酸數目命名為?VEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A148、VEGF-A165、VEGF-A183、VEGF-A189、VEGF-A206。VEGF-A165（VEGF165）具有最佳的生物利用度和生物潛能，是最重要的同源單體。缺少由外顯子?6編碼的殘基，有肝素結合位點，既可以分泌到細胞外也可以結合到細胞表面或細胞外基質。

血管內皮細胞生長因子是目前已知作用最強、專屬性最高的促血管生長因子。作用強，其作用于血管內皮細胞，強烈刺激細胞增生，促細胞分裂，促進血管的生長和側支循環的建立，并有升高血管通透性的作用。專屬性高，是唯一對血管形成具有特異性的重要生長因子，其他生長因子如成纖維細胞生長因子、血小板衍生性生長因子等能作用于包括血管內皮細胞在內的多種細胞，是不具特異性的。

血管內皮細胞生長因子正常生理作用包括：（1）正常組織內促血管內皮細胞生長因子和抗血管內皮細胞生長因子同時存在，且保持相對平衡，這種平衡使得人體脈管可以正常地生成和分化。（2）人體血管內皮細胞表面分布著一定數量的VEGF受體，稱為VEGFR。血液中的VEGF與受體結合，從而激活胞內酪氨酸激酶，啟動下游細胞信號級聯，進而促使新脈管生長。在腫瘤生長中促進大量不規則新血管生成。正常人體內促血管內皮細胞生長因子和抗血管內皮細胞生長因子數量相對平衡，在有腫瘤生長的情況下，多種致癌因素觸發致使促血管內皮細胞生長因子的數量激增，遠遠超過抗血管內皮細胞生長因子的作用，以血管為主的脈管大量生長，為腫瘤提供了優越的生長環境。

基于VEGF?在體內所表現出的特異性促血管生成作用，通過抑制VEGF?的血管生成作用和應用VEGF?促進血管生成治療疾病，正在作為一種新的治療方法被應用于臨床。VEGF治療方法包括轉基因治療及應用VEGF?成品。VEGF基因治療稱為分子搭橋術，為動脈缺血性疾病的治療提供了極其誘人的前景。它通過將含有表達VEGF?的cDNA?通過載體直接導入動物體內，使其在體內表達VEGF，從而實現體內的治療作用。由于VEGF?在體內的半衰期較短，而應用VEGF的轉基因治療可以克服這一不足。眾多研究表明VEGF可以縮小腦梗死體積、減輕腦水腫和減輕神經元損傷。外源性VEGF可誘發正常成體腦的血管生成，有助于增加腦梗死邊緣的腦血流和代謝。

由于天然來源的血管內皮細胞生長因子很少，遠遠不能滿足臨床應用的需求，需要應用DNA重組技術大量生產VEGF蛋白。利用哺乳動物細胞及酵母細胞表達VEGF蛋白成本高、產量低、表達不穩定，并且后續分離純化工藝繁瑣。大腸桿菌由于遺傳背景清楚，代時短，易控制，成為生產重組蛋白的主要工程菌。可是利用大腸桿菌表達系統得到的VEGF蛋白為不可溶的無活性包涵體，純化復性困難，步驟復雜，總回收率低。

rhVEGF165在中國倉鼠卵巢細胞中的穩定表達、純化及其生物學活性（張甘良、張海峰等，生物工程學報，2011,27(6):935~942）中公開了將VEGFl65克隆于表達載體pCDNA4.0，與T-GS載體共同轉染CHO-S(中國倉鼠卵巢細胞)細胞，表達VEGF165。該方法使用哺乳動物細胞表達蛋白，生產周期長、成本高、產量較低，不適合工業化生產。