[發明專利]一種抗氯胺酮雜交瘤細胞株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210588531.8
• 申請日: 2012-12-29
• 公開（公告）號: CN103060275A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 陳東;邵越水;鄭孝君
• 申請（專利權）人: 杭州傲銳生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/94;G01N33/577
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗氯胺酮雜交瘤細胞株、該抗氯胺酮雜交瘤細胞株作為分泌抗氯胺酮單克隆抗體的應用，以及制備該抗氯胺酮雜交瘤細胞株并分泌抗氯胺酮單克隆抗體的方法。

背景技術

氯胺酮（Ketamine，KET）,化學名為2-鄰氯苯基-2-甲胺基-環己酮，其結構式為：

氯胺酮（Ketamine）是一種非巴比妥類靜脈麻醉劑，主要用于手術麻醉劑或者麻醉誘導劑。氯胺酮具有一定的興奮、致幻和依賴性，服用后產生意識與感覺的分離狀態,?導致神經中毒反應﹑幻覺和精神分裂狀態,?表現為頭暈﹑精神錯亂﹑過度興奮﹑幻覺﹑幻視﹑幻聽﹑運動功能障礙﹑抑郁以及出現怪異和危險行為,?對記憶和思維能力都制造成嚴重損害,?以及心力﹑呼吸衰竭。吸食過量或長期吸食,可以對心﹑肺﹑神經都造成致命損傷甚至死亡。固體氯胺酮，其形狀通常呈白色粉末，俗稱“K粉”，是娛樂場所的常用毒品。近年來，其濫用現象日益嚴重，具有極大的社會危害性，2001年5月9日,?K粉被中華人民共和國國家藥品監督局列入第二類精神藥品加以管理,2007年,升為第一類精神藥品。

氯胺酮膠體金試紙條產品具有快速，操作簡單等優點，提供了一種有效的現場檢測手段，由于其核心原料氯胺酮單抗的靈敏度所限，現有商業化產品的檢測閾值在1000ng/ml左右，已經不能滿足檢測閾值100ng/ml的要求，所以亟待開發出高靈敏度的氯胺酮抗體，以適應檢測需要。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種抗氯胺酮雜交瘤細胞株。

本發明抗氯胺酮雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株3E7.1，于2012年11月28日保藏于中國典型培養物保藏中心(China?Center?for?Type?Culture?Collection，簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC?NO:C2012157；中國典型培養物保藏中心的地址為：湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心(武漢大學第一附屬小學對面)。

本發明的另一個目的是提供該雜交瘤細胞株3E7.1作為分泌抗氯胺酮單克隆抗體的應用，分泌出的抗氯胺酮單克隆抗體屬于IgG1亞型，輕鏈是kappa鏈，。

本發明的又一個目的是提供制備該雜交瘤細胞株3E7.1并分泌抗氯胺酮單克隆抗體的方法，該方法包括步驟如下：

步驟(1).氯胺酮人工抗原的制備

1-1.氯胺酮半抗原的制備：以鹽酸氯胺酮為原料，游離后與溴乙酸乙酯進行取代反應引入酯基，得到氯胺酮的酯，然后在堿性條件下水解得到含羧基的氯胺酮半抗原：

將200mg鹽酸氯胺酮溶于10ml去離子水中，加入氨水調PH值至10，加入90ml二氯甲烷萃取3次，收集有機相，用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸干溶劑，得到游離態氯胺酮；將游離態氯胺酮溶于10ml丙酮中，加入121μl溴乙酸乙酯和300mg碳酸鉀,70℃下回流反應16h，冷卻至常溫，過濾，得到濾液；濾液減壓蒸餾得到氯胺酮的酯；取100mg氯胺酮的酯、2ml四氫呋喃、2.5ml甲醇混合均勻，加入10ml濃度為1M的氫氧化鈉溶液,常溫反應16h；加入鹽酸調PH值至7，用乙酸乙酯萃取1次，收集有機相，減壓蒸餾得到氯胺酮半抗原。經高效液相色譜純化，純度≥99.8﹪。

1-2.氯胺酮人工抗原的制備：通過碳二亞胺法使氯胺酮半抗原與牛血清蛋白(BSA)結合制備氯胺酮人工抗原，即氯胺酮-牛血清蛋白：

將100mg氯胺酮半抗原、5ml?N,N-甲基甲酰胺(DMF)、59mg?N-基琥珀酰亞胺(NHS)、105mg環己基碳酰二亞胺(DCC)混合均勻，常溫反應16h,反應結束后離心取上清液，得到A液；將150mg牛血清蛋白加入到30ml?PBS緩沖液混合均勻，得到B液；將A液和B液按體積比為1:5混合均勻，4℃下反應16h，得到人工抗原混合液；將人工抗原混合液移入透析袋中，用PBS緩沖液透析5次，透析結束后離心取上清液，得到氯胺酮人工抗原；?

步驟(1)的反應過程如下：

步驟(2).小鼠免疫