[發明專利]一種離體高效構建多拷貝解脂耶氏酵母表達載體及其應用方法

有效

• 申請號: 201210587997.6
• 申請日: 2012-12-29
• 公開（公告）號: CN103060368A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 馬立新;趙西選;陳羽西;李曄星;張玲;姚永蘭
• 申請（專利權）人: 湖北大學;湖北花果山實業有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/64;C12N15/66;C12R1/645
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

技術領域

本發明涉及離體高效構建多拷貝解脂耶氏酵母表達載體及其應用方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

隨著基因工程技術的迅速發展，如何提高目標蛋白在宿主菌的表達量和穩定性受到了國內外的高度重視。尤其是一些具有生物活性的小分子多肽如抗菌肽受到高度的關注。但由于其分子量較小，表達量低，在細胞中的穩定性不好，因此易被宿主蛋白酶降解成沒有活性的寡肽。另外，產物對宿主具有毒性如抗菌肽在表達過程中通常會抑制宿主菌的生長甚至直接殺死宿主菌，這些限制性因素被認為是制約抗菌肽表達量提高的直接原因。將多肽基因串聯表達可有效解決以下問題：（1）串聯增加目的基因數量，有利于提高表達量；（2）多聚體的串聯表達能有效屏蔽宿主毒性；(3)隨著多聚體聚合度增加，多聚體表達產物更穩定，多聚體半衰期不斷延長。因此，通過構建多聚體方法對于提高小分子肽的表達量有突出優勢。然而對于一些含有二硫鍵的多肽或分子量較大蛋白的表達或許將面臨構象正確折疊和二硫鍵復性的棘手問題，隨著串聯單體增加，其構象折疊和二硫鍵復性情況也越來越復雜，同時也不易保持產物活性。而以含有目的基因的完整表達盒式結構為基本單元構建多拷貝重組載體，表達產物全部為目的蛋白單體，不但可以提高蛋白表達量而且能有效解決上述難題。

現有技術中，目標蛋白在宿主菌里的表達有很多種方法，酵母表達方法是人們常用的方法，酵母表達方法常用的有五種表達系統（釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、粟酒裂殖酵母、多形漢遜酵母和解脂耶氏酵母）。其中解脂耶氏酵母表達系統最好。

解脂耶氏酵母（Yarrowia??lipolyica）于1942年首次被分離得到的。由于解脂耶氏酵母能利用烷烴等多種比較常見的廉價物質作為底物來大量分泌代謝產物，在20世紀90年代將其開發成為一種優良的酵母表達系統。

解脂耶氏酵母沒有天然質粒，也沒有除基因組外的附加體質粒。解脂耶氏酵母表達載體包括整合型質粒和游離型的自我復制的質粒。整合型表達載體的元件包括：啟動子、信號肽序列(分泌型表達載體)、多克隆位點、終止序列、選擇性標記和抗性基因。解脂耶氏酵母常用的分泌型表達載體有pINA1291，pINA1293，pINA1296，pINA1297，pINA1313。比較常用的主要是：pINA1296，pINA1297。

但是，該表達系統也還存在表達量不十分理想和穩定性有待進一步提高的問題。

發明內容

本發明的目的是提出一離體高效構建多拷貝解脂耶氏酵母表達載體及其應用方法，對解脂耶氏酵母表達載體pINA1296進行改造，以優化克隆方式和提高目的蛋白的表達量。

具體做法如下：

1）根據NEB公司產品目錄查找pINA1296載體的啟動子和終止子區域及構成載體的其它元件，其中可以利用的同尾酶分別加在啟動子上游和終止子下游，然后設計4條引物（5'agcaccAAGCTTGCTAGCgccgccgcaaggaatggt?3'、5'gaattcGGATCCTCTAGAggacacgggcatctcacttgca3'、5'TCTAGAGGATCCgaattctcatgtttgacagcttatcatcg3'、5'GCTAGCAAGCTTggtgctcaacggcctcaacctac?3'），分別PCR擴增包括以啟動子和終止子為區域的小片段及以載體的其他框架為區域的大片段，大片段和小片段大小分別為1065bp和6164bp左右（序列表對應NO?1、2），。通過PCR的方法獲得兩個大小不同的片段后，產物經過瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，再用DpnI?37°C消化3h以消除質粒背景，將兩個片段混合通過無酶克隆的方式轉化大腸桿菌XL10-Gold。

所述PCR方法的條件為98℃，2min，1?cycle;?98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min,?30cycle；72℃，8min,?1?cycle；4℃保存。

2）轉化的大腸桿菌XL10-Gold??37?°C生長12?h后，從平板隨機挑取單菌落，小量提取質粒DNA與原始的pINA1296進行大小比對，初步確定為所需的重組子，命名為pINA1296I，該pINA1296I即為新改造構建的用于多拷貝解脂耶氏酵母表達載體（序列表對應NO?3）。

3）驗證重組是否成功。

本發明的應用方法為：

1、選擇需表達的目的基因（xxx），例如甘露聚糖酶、植酸酶等。

2、重組含目的基因的質粒。