[發(fā)明專利]一種提取黑海參糖胺聚糖的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210586295.6
• 申請日: 2012-12-30
• 公開（公告）號: CN103044565A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 辛永寧;林中華;宣世英;姜相君;姜曼;李雪潔
• 申請（專利權(quán)）人: 青島市市立醫(yī)院
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00
• 代理公司: 山東清泰律師事務(wù)所 37222
• 代理人: 聶磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，具體涉及一種提取黑海參糖胺聚糖的方法。

背景技術(shù)

隨著人口老齡化程度的提高，心腦血管疾病已經(jīng)成為人類健康的最大威脅。據(jù)報道心腦血管疾病是老年人的三大主要死亡原因之一，目前因心腦血管疾病死亡者占總死亡人數(shù)的34%，在存活中約有3/4左右的患者有不同程度的勞動能力和生活自理能力的喪失。而缺血性中風(fēng)是心腦血管中最常見的一種疾病，占腦血管病的43~65%，該疾病發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高，嚴重的危害著人類生存和生活質(zhì)量。中風(fēng)病世界人口標(biāo)化發(fā)病率為239.4/10萬，其中缺血性中風(fēng)占53.6%。隨著人口老齡化和人類生活方式的變化，其發(fā)病率還有逐年增長的趨勢。心腦血管疾病已成為人類死亡的頭等原因，因此積極開展預(yù)防該疾病的藥物研制和開發(fā)迫在眉睫。

海洋是一個巨大的天然產(chǎn)物寶庫，豐富的海洋生物和海洋活性物質(zhì)為我們提供一個巨大的海洋藥物資源庫。特殊的海洋生態(tài)環(huán)境與生物鏈之間的密切相關(guān)性使得海洋生物次生代謝產(chǎn)物具有與陸生生物所不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特異高效的生物活性，因此對海洋生物多糖的開發(fā)應(yīng)用具有重大意義。從海洋活性多糖中尋找具有抗凝血作用的有效藥物，已引起國內(nèi)外醫(yī)藥界的密切關(guān)注。

糖胺聚糖,舊稱酸性粘多糖或粘多糖。黑海參糖胺聚糖具有抗凝、纖溶、降低血粘度、調(diào)節(jié)血脂等活性，作用于缺血性中風(fēng)（腦梗死）的各個環(huán)節(jié)，從而達到治療缺血性中風(fēng)的目的。糖胺聚糖是海參中與中風(fēng)治療有關(guān)的主要藥效成分；但是，目前從黑海參中提取的黑海參糖胺聚糖為粗品，不能直接用于制成注射劑。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種提取黑海參糖胺聚糖的方法，將黑海參糖胺聚糖用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱法純化，得到純度較高的黑海參糖胺聚糖。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種提取黑海參糖胺聚糖的方法，包括下列步驟：步驟一：黑海參預(yù)處理；步驟二：堿解黑海參體壁；步驟三：雙酶酶解黑海參體壁；步驟四：酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五：用乙醇沉淀黑海參糖胺聚糖；步驟六：干燥黑海參糖胺聚糖粗糖；步驟七：依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化黑海參糖胺聚糖；步驟八：雙氧水脫色；步驟九：用乙酸鉀沉淀黑海參糖胺聚糖；步驟十：干燥黑海參糖胺聚糖精糖。

優(yōu)化的，所述步驟七中凝膠柱純化的具體步驟為：將40g葡聚糖凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用10mL緩沖液在40～60℃下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。

優(yōu)化的，所述緩沖液采用0.5mol/L的NaAC/HAC，其pH為6.0～6.5。

本發(fā)明中所述DEAE-52纖維素為二乙氨基乙基纖維素，sephadex?g-100凝膠為葡聚糖凝膠，本發(fā)明對采用的試劑、材料和儀器沒有特殊要求，其均為市售產(chǎn)品，可通過多種商業(yè)渠道購得。

本發(fā)明的有益效果在于：建立了一種有效地制備高純度的黑海參糖胺聚糖的方法，在堿法提取的同時，結(jié)合胰蛋白酶和胃蛋白酶的雙酶消化處理，即首先采用堿處理黑海參組織，再用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解，以增強黑海參體壁組織匯總糖胺聚糖的釋放。為提高糖胺聚糖的純度，本發(fā)明采用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱法純化黑海參糖胺聚糖粗糖。本發(fā)明的方法能夠平衡黑海參糖胺聚糖的得率與純度的關(guān)系，提高了黑海參糖胺聚糖的純度。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1

本實施例的從黑海參中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步驟：步驟一：黑海參預(yù)處理；步驟二：堿解黑海參體壁；步驟三：雙酶酶解黑海參體壁；步驟四：酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五：用乙醇沉淀黑海參糖胺聚糖；步驟六：干燥黑海參糖胺聚糖粗糖；步驟七：依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化黑海參糖胺聚糖；步驟八：雙氧水脫色；步驟九：用乙酸鉀沉淀黑海參糖胺聚糖；步驟十：干燥黑海參糖胺聚糖精糖。

各步驟的具體方法為：

步驟一：黑海參預(yù)處理；迅速用蒸餾水沖洗黑海參，去除黑海參體表粘附的異物，用長形小刀自腹部僅肛門向前解剖鮮參，立即剔除內(nèi)臟，迅速用雙蒸水洗去污物，稱量后將黑海參體壁置于潔凈的大燒杯中，剪碎黑海參體壁；