[發明專利]一種快速灌制聚丙烯酰胺凝膠的試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201210586042.9
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103013982A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 趙波濤;蔡春海;楊德華
• 申請（專利權）人: 上海啟動元生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07K1/26;G01N27/447
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 孫春玲

技術領域

本發明所屬領域為生物大分子檢測領域，特別是涉及聚丙烯酰胺凝膠大分子檢測領域。

背景技術：

在研究和診斷領域，聚丙烯酰胺凝膠是一種廣泛運用的用于分離生物大分子（如脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、多肽、蛋白質以及它們的復合物等）的分離介質。運用此項技術的基本裝置為一個兩端開口的細管或一個三明治型的兩塊平板。細管和平板用具有一定的支持強度的材質制作，如玻璃和塑料等。首先將尚未凝固的聚丙烯酰胺溶液加入到上述形狀的模具中，待聚丙烯酰胺凝固成膠后，可將生物樣品加到凝膠的一端，凝膠的兩端分別加上正負極電極，使生物樣品分子在凝膠介質中移動。由于生物樣品分子的移動速度不同，因而在一段時間后，不同移動速度的生物分子就能被有效分開。一般生物樣品分子或經處理以后的生物樣品分子帶有負電荷，電泳過程中，它們從負極向正極移動。

在一定電場下，生物分子在介質上的移動速率（泳動速率）取決于生物分子本身的電荷/質量比、生物分子的形狀和大小以及介質的孔徑。針對確定的樣品，前兩者是生物分子本身的特征，一般不會改變。操作者可以改變電泳介質的孔徑來影響生物分子的泳動速率。聚丙烯酰胺凝膠的孔徑首先取決于凝膠體系中丙烯酰胺單體及交聯劑單體的總質量-體積濃度，即所謂的丙烯酰胺單體溶液的總質量-體積濃度，用%T表示，即%T=（丙烯酰胺單體質量+交聯劑單體質量）（克）÷溶液總體積（毫升）×100%。越高的%T濃度，使形成的凝膠孔徑越小，適合用于分離小分子量的生物分子。越低的%T濃度，使形成的凝膠孔徑越大，適合用于分離大分子量的生物分子。常用的分離生物分子的聚丙烯酰胺凝膠濃度為4%-30%不等。影響聚丙烯酰胺凝膠的另一個因素是交聯劑單體質量占所有單體的質量百分比，用%C表示，即%C=交聯劑單體質量÷（丙烯酰胺單體質量+交聯劑單體質量）×100%。在總的單體濃度（%T）確定的情況下，使用越少的交聯劑（%C越小）獲得的凝膠孔徑越大，反之亦然。常用的用于核酸分子分離的凝膠的%C為5%；用于蛋白分子分離的凝膠的%C為3.3%或2.6%。此外還有其他一些原因可能會帶來孔徑大小的變化，如不完全的凝結和凝膠的水解等。

凝膠介質中還含有用于調節pH值、離子強度等的緩沖液體系。一般用于核酸電泳，凝膠的緩沖液常為TAE(40mMTris-乙酸，10mM?EDTA)和TBE(90mM的Tris堿，90mM的硼酸和2mM的EDTA)。在非變性核酸電泳時，電泳過程保持在較低的溫度，以維持核酸的結構，特別是用于分離核酸和蛋白質復合物的時候。如要使得分離的核酸分子變性（雙鏈DNA解鏈；單鏈DNA和RNA二級結構解體），常在緩沖體系中加入足量的變性劑，如尿素和甲酰胺等，并維持較高的電泳溫度。其它用于核酸電泳的緩沖液體系還有Tris/磷酸和Tris/雙甘氨肽等。電泳緩沖液也使用同樣成分的緩沖液，然而在核酸的變性電泳時，電泳緩沖液中常無需添加變性劑。

蛋白分子表面由于沒有大量的負電荷，大多數蛋白電泳都在變性條件下進行，在此條件下，蛋白在上樣緩沖液中預先處理，使蛋白表面結合上大量帶負電荷的SDS（十二烷基硫酸鈉）分子基團，能夠在電場力的驅動下有效泳動，即所謂的SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE凝膠灌制的緩沖體系常用的是Laemmli體系（Laemmli,U.K.(1970）Nature，227,680-686.)。Laemmli體系包括分離膠和濃縮膠（也稱為積層膠）兩部分：分離膠的緩沖液為0.375M的Tris（用HCl滴定到pH8.8），濃縮膠的緩沖液為0.125M的Tris（用HCl滴定到pH6.8）。正負極電泳緩沖液為0.024M的Tris，0.192M的甘氨酸和0.1%的SDS。另一種常用的緩沖液體系（Schaegger體系）（Schaegger,H.and?van?Jagow，G.,（1987）Anal.Biochem.166,368-379）為：濃縮膠緩沖液含0.75MTris，HCl滴定到pH8.45；分離膠緩沖液含0.9MTris，HCl滴定到pH8.45；負極緩沖液為0.1MTris和0.1MTricine，含0.1%SDS。正極緩沖液為0.2MTris。其它緩沖液包括磷酸鹽緩沖體系、Bis-Tris緩沖體系、Tris-乙酸體系、雙甘氨酸肽-NaOH體系、PIPES-磷酸鈉體系、HEPES/MOPS/MES/Bicine-NaOH體系、MOPS-KOH體系等。如要在非變性條件下分離蛋白質分子，則需在凝膠和緩沖液中忽略SDS。