[發明專利]一種重組腸激酶的制備方法

無效

• 申請號: 201210585576.X
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103898145A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 文良柱;梅麗;朱亮
• 申請（專利權）人: 江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司;上海復星醫藥(集團)股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/57;C12N1/21;C12N9/64;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種重組腸激酶的制備方法。

背景技術

腸激酶(Enterokinase，EK)是存在于哺乳動物十二指腸內的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21.9)。天然腸激酶分子量為150kDa，由1條115kDa重鏈和1條35kD輕鏈組成，重鏈負責在消化道細胞膜上的錨定以及與腸激酶融合蛋白的結合，輕鏈具有催化活性，可以特異性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并在其羧基端切割，將腸激酶融合蛋白活化為腸激酶，從而啟動消化道內各種酶原活化的級聯反應。

由于腸激酶識別位點的特異性和切割后在目標蛋白N末端不留任何氨基酸殘基，而且可以在pH?4.5～9.5、溫度4～45℃范圍內特異性水解蛋白底物，因此它已經成為基因工程制藥領域融合蛋白切割的的首選工具酶，廣泛應用于各種重組蛋白、多肽藥物的加工成熟。天然的腸激酶來源有限，需從動物組織分離提取，因為從動物組織提取的腸激酶易殘留其他的蛋白酶，對融合蛋白的產生降解；另外，來源于動物組織的腸激酶可能帶有未知病毒等動物源性污染，為藥物蛋白生產增加了額外的風險。通過基因工程的方法生產的腸激酶輕鏈，具有天然腸激酶的全酶活性和特異性，在融合蛋白切割中被廣泛應用。已有報道的重組腸激酶輕鏈多為實驗室級別，存在大量宿主蛋白殘留、鎳離子殘留和其他雜質，而且作為原輔料進行藥物蛋白生產時，其殘留不能被有效檢測和控制，對藥用蛋白的生產中增加許多風險。

發明內容

本發明提供一種重組腸激酶的制備方法，以克服現有技術中重組腸激酶輕鏈多為實驗室規模制備，存在大量宿主蛋白殘留、鎳離子殘留和其他雜質的技術缺陷。

本發明的思路是這樣的：通過合成N端帶有腸激酶酶切位點的基因，連接到pET-32a(+)質粒中硫氧還蛋白后，在大腸桿菌宿主細胞內融合表達，表達的融合蛋白經外加少量腸激酶后，啟動自切割，從而生產具有正確結構的重組腸激酶輕鏈，分子量約為35KD，含有活性重組腸激酶(35KD)的溶液經陰離子交換層析、陽離子交換層析和疏水層析和冷凍干燥后，可得高純度、適合藥用蛋白生產的重組腸激酶產品。

發明人經過大量創造性勞動或得了本發明。

本發明所要解決的技術問題之一是：提供一種包含腸激酶基因的表達載體。

本發明所要解決的技術問題之二是：提供一種包含腸激酶基因的工程菌。

本發明所要解決的技術問題之三是：提供一種重組腸激酶的制備方法。

因此，本發明的技術方案如下：

1.一種包含腸激酶基因的表達載體，其特征在于腸激酶基因序列為Seq?ID?No.1。

2.根據1的表達載體，其特征在于，腸激酶基因Seq?ID?No.1插入質粒pET-32a(+)的BglII和XhoI酶切位點之間。

3.一種包含腸激酶基因的工程菌，其包含1或2所述的表達載體。

4.一種包含腸激酶基因的工程菌，其特征在于，由將2所述的表達載體轉化大腸桿菌BL21DE3而獲得。

5.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟：

(1)培養3所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達；

(2)收集菌體；

(3)破碎菌體；

(4)收集包涵體，洗滌包涵體；

(5)包涵體復性；

(6)腸激酶原活化；和，

(7)活性腸激酶的純化。

6.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟：

(1)培養4所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達；

(2)收集菌體；

(3)破碎菌體；

(4)收集包涵體，洗滌包涵體；

(5)包涵體復性；

(6)腸激酶原活化；和，

(7)活性腸激酶的純化。