[發明專利]一種海洋微生物來源的海藻糖合成酶及其編碼基因與應用

無效

• 申請號: 201210585409.5
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103013967A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 高云;劉小宇;劉軍華;奚悅;胡波;盧小玲;焦炳華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12N5/10;C12N1/21;C12P19/24;C12R1/19
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發明涉及海洋生物技術領域，具體涉及一種海洋微生物來源的海藻糖合成酶及其編碼基因與應用。

背景技術

海藻糖是一種穩定的非還原性二糖，廣泛存在于細菌、真菌、酵母、昆蟲和多種植物體內。由兩個吡喃環葡萄糖以α-1,1-糖苷鍵連結而成，海藻糖有3種光學異構體，其中αα型海藻糖是最常見的海藻糖。αβ和ββ型在自然界中很少存在，αα型海藻糖結構式如式(I)所示。

海藻糖的化學性質穩定。口感略帶甜味。其理化性質穩定，不能使斐林試劑還原，也不能被α-糖苷酶水解，但能被海藻糖酶水解為兩個葡萄糖分子。海藻糖在生物體內具有保護作用，它能在低溫、脫水、高溫、氧化應激等極端條件下保護生物大分子免于損害。海藻糖由于其特殊的性質，在生物醫藥、食品、化妝品行業有廣泛的應用前景。

早期的海藻糖制備方法包括化學合成法和微生物抽提法，特別是酵母提取法曾經是海藻糖的主要商品生產方式。但通過這些方法生產海藻糖制造成本過高，價格昂貴，近年來己經逐步被淘汰。

酶法生產海藻糖已逐步成為海藻糖生產的主要方式。目前在生物體內共發現有五條海藻糖生物合成途徑，其中有三條途徑被詳細研究。第一條途徑是TPS-TPP途徑，是生物體內分布最為廣泛的一種合成海藻糖的途徑。但由于底物有高能磷酸物質：葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖，價格昂貴，不適合工業化生產（Pan?YT?et?al.Trehalose-phosphate?synthase?of?Mycobacterium?tuberculosis.Cloning,expression?and?properties?of?the?recombinant?enzyme.Eur?J?Biochem2002,269:6091-6100）。第二條途徑（TreY-TreZ）是利用淀粉或麥芽寡聚糖為底物，首先在麥芽寡糖基海藻糖合成酶（TreY）的作用下生成麥芽寡聚海藻糖，接著在麥芽寡糖基海藻糖基海藻糖水解酶（TreZ）的作用下再生成海藻糖。1994年日本林原生化研究所首次發明了通過這兩種酶生產海藻糖的方法，該方法以淀粉為底物，在TreY和TreZ的協同作用，由淀粉直接生產海藻糖。配合其它淀粉水解酶，海藻糖轉化率可達70%。目前，世界上已有少數幾家公司掌握該途徑生產海藻糖的方法(Nakada?T?et?al.Purification?and?properties?of?a?novel?enzyme,maltooligosyl?trehalose?synthase,from?Arthrobacter?sp.Q36.Biosci?Biotechnol?Biochem1995,59:2210-2214)。第三條途徑是TreS途徑，是由TreS基因編碼的海藻糖合成酶通過分子內轉糖基作用，一步反應催化麥芽糖與海藻糖間的相互轉化(Nishimoto?T,et?al.Purification?and?properties?of?a?novel?enzyme,trehalose?synthase,from?Pimelobacter?sp.R48.Biosci?Biotechnol?Biochem1996,60:640-644)。

第二，三條途徑在自然界的微生物中廣泛存在，有多個菌屬含有上述單酶或雙酶系，但多存在于極端環境微生物及古細菌中，或是在極端環境下誘導生成。關于海藻糖生成和代謝機制的研究一直是極端微生物((Extremophiles)研究的熱點課題。但海藻糖合成酶基因的編碼特征特殊，在異源生物中不易表達，或表達量偏低，因此雖然有大量論文發表，但很少有依據基因工程表達申報的專利公開，據此推測相關技術尚待研究開發。

經過聯網檢索，關于海藻糖的酶法轉化共檢索到多個專利。南寧中諾生物工程有限責任公司公開的一種海藻糖合成酶，在40L發酵罐水平上表達，以27.27%的麥芽糖為底物，轉化時間32h，轉化率70%，是目前國內生產海藻糖的主要方法（發明名稱為“谷氨酸棒桿菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法”，公開號為CN1563371A）。廣西大學公開一種的來源于褐色喜熱裂孢菌（Thermobifida?fusca）的海藻糖合成酶（發明名稱為“T.fusca海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法”，公開號為CN1563372A）以麥芽糖漿為底物,可產生40－70%的海藻糖。