[發明專利]降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白及其編碼基因

無效

• 申請號: 201210585364.1
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103031293A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 余瓊
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/62
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種融合蛋白及其編碼基因。

背景技術

Rosenfeld等于1983年發現降鈣素基因相關肽（CGRP）是一種生物活性肽，它與降鈣素（CT）均來源于位于11號染色體的CT/CGRP基因，但是由于CT/CGRP基因不同的RNA編碼而翻譯成CGRP和CT，CGRP是應DNA基因重組和分子生物技術研究發現的一種由37個氨基酸組成的生物活性多肽，是目前發現的最強的內源性擴血管肽類物質，對神經、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系統具有重要作用。CGRP的舒張冠狀血管的作用遠強于P物質，心鈉素和去甲腎上腺素（NE），比乙酰膽堿（Ach）、5-羥色胺（5-HT）等強10000倍左右，比異丙腎上腺素強10-100倍。????

犬鉤蟲吸血時，其頭腺能分泌一種抗凝血活性物質，被稱作犬鉤蟲抗凝血肽（anticoagulant?peptide，AcAPs）。該物質本質是一種蛋白水解酶，具有延長血漿凝血酶原時間(pt)、抑制血液凝固以及促進纖維蛋白溶解的作用。目前發現的AcAPs有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三種重組蛋白，其中AcAPc2(10KD)是Xa因子的高效特異抑制劑，其抗血栓效果明顯優于凝血酶抑制劑，AcAPc2作為Xa因子的高效特異抑制劑對血小板聚集功能影響甚小，用于抗血栓治療時引發出血的危險性小。1998年，Donnelly等報道AcAPc2在體內還具有抗腫瘤細胞轉移的作用。AcAPc2的抗凝血、抗血栓作用，使之具有成為臨床上一種新的抗凝劑和抗血栓治療藥物。

然而目前這兩種蛋白單獨作用，效果單一。

發明內容

本發明的目的在于提供降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白及其編碼基因，以期獲得一種能同時具有治療高血壓和抗血栓雙重作用的融合蛋白，兩種蛋白之間作用互補且協同增效。

本發明降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

上述降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發明的有益效果：本發明進行合理設計，將降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合，兩者之間作用互補且協同增效，所得融合蛋白經實驗證實具有很好的抗血栓和治療高血壓的作用。本發明的融合蛋白可由于制備抗血栓及預防和治療高血壓疾病的藥物，為抗凝血及預防和治療高血壓疾病的研究打下基礎。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

本實施方式降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白的制備方法，按以下步驟進行：

一、融合蛋白CGRP/AcAPc2基因的合成：CGRP和AcAPc2融合基因內設計一個KpnⅠ酶切位點，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因兩端分別添加BamHI和EcoRⅠ酶切位點，然后克隆在pUC57載體上，獲得pUC（CGRP/AcAPc2）載體；

二、重組表達載體的構建：將步驟一獲得的pUC（CGRP/AcAPc2）載體用BamHI和EcoRⅠ雙酶切，再與同樣經BamHI和EcoRⅠ雙酶切的表達載體pGEX-6P-1連接，獲得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重組表達載體pGEX-CGRP/AcAPc2；

三、基因工程菌株的構建：然后將載體pGEX-CGRP/AcAPc2轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中，隨機挑取轉化菌37℃過夜培養，采用質粒提取試劑盒（購買自北京艾德萊生物科技有限公司）提取質粒DNA，用KpnⅠ單酶切，并用相應的空白質粒pGEX-6P-1作為對照，將含有KpnⅠ酶切位點的質粒進行基因測序，測序結果正確的即為陽性重組菌；其中大腸桿菌BL21（DE3）為購買得到；

四、融合蛋白的誘導表達與純化：將陽性重組菌置于LB培養基28℃培養15h，然后采用GST標簽融合蛋白方法進行蛋白的分離純化，本實施方式降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白的純度為98%，融合蛋白表達量為38.1%。

步驟二中pUC（CGRP/AcAPc2）載體用BamHI和EcoRⅠ雙酶切的體系如下：