[發明專利]生產DL-丙氨酸的工程菌及利用該工程菌生產DL-丙氨酸的方法

有效

• 申請號: 201210584472.7
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103045528A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 張學禮;張冬竹
• 申請（專利權）人: 安徽華恒生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;王慧鳳

技術領域

本發明涉及DL-丙氨酸生產領域，具體涉及一種生產DL-丙氨酸及利用該工程菌生產DL-丙氨酸的方法。

背景技術

DL-丙氨酸主要用于食品加工業，用作營養增補劑及調味料，具有良好的鮮味，可以增強調味料的調味效果。其次用于醫藥工業，用于合成一些農藥、醫藥和醫藥中間體。

目前，DL-丙氨酸的生產主要是通過酶催化技術(丙氨酸消旋酶)或化學消旋法來生產，而化學消旋法因需要以有機酸為溶劑，存在著污染環境和收率偏低等缺點，因此逐漸被淘汰。酶催化技術是先將葡萄糖發酵生成L-丙氨酸，再將L-丙氨酸通過酶催化轉化成D-丙氨酸，在該方案中，DL-丙氨酸積累量為30～50g/L，產率偏低，且生產周期長；其次，需要對菌株進行高密度培養以分泌生產DL-丙氨酸所需的丙氨酸消旋酶，該過程對氧氣的需求量大；另外，由于丙氨酸消旋酶基因是克隆在質粒上進行高表達的，因此在菌株培養過程中，需要添加抗生素來維持質粒的穩定遺傳復制。因此該方案也不易實現工業化生產。

發明內容

本發明的首要目的是提供一種生產DL-丙氨酸的工程菌，該工程菌可利用葡萄糖直接生產DL-丙氨酸，且生產周期短、DL-丙氨酸的產率高。

為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：該生產DL-丙氨酸的工程菌，是將出發細菌染色體上的乳酸脫氫酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因、丙氨酸消旋酶基因、甲基乙二醛合成酶基因滅活；且其染色體上整合了外源的L-丙氨酸脫氫酶基因和外源的丙氨酸消旋酶基因，篩選得到生產DL-丙氨酸的工程菌。所述滅活的方法為敲除、插入突變、或利用小RNA干擾所述基因的表達。

由于細菌在代謝過程中進行L-丙氨酸合成代謝，因此上述限定的方案可在常用所有細菌中實現，本身申請中優選選用大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)(統稱大腸桿菌)作為生產DL-丙氨酸的工程菌的構建細菌。

所述外源的L-丙氨酸脫氫酶基因來自于嗜熱脂肪地芽孢桿菌；所述外源的丙氨酸消旋酶基因來自于枯草芽孢桿菌，優選來源于枯草芽孢桿菌168；丙氨酸消旋酶的失活主要是指大腸桿菌自身的丙氨酸消旋酶(DadX)基因被敲除。

上述構建方案中直接將alaR基因整合到生產L-丙氨酸的大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)XZ-A26菌株(CN?102329765A)內。XZ-A26菌株于2010年7月26日保藏在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC?No.4036。XZ-A26菌株中的乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶、乙醇脫氫酶、乙酸激酶、富馬酸還原酶、丙氨酸消旋酶均已被失活且其染色體上已經整合了外源的L-丙氨酸脫氫酶基因，因此只需要在XZ-A26菌株染色體上整合外源丙氨酸消旋酶基因，并敲除甲基乙二醛合成酶基因即可。若用原始的細菌構建本發明中生產DL-丙氨酸工程菌，可采用敲除細菌自身染色體上的乳酸脫氫酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因、丙氨酸消旋酶基因、甲基乙二醛合成酶基因，并整合外源的L-丙氨酸脫氫酶和丙氨酸消旋酶基因來達到相同效果，敲除和整合上述基因的方法可按照名稱為“一種高產L-丙氨酸的XZ-A26菌株及構建方法與應用”(CN?102329765A)的中國專利文件中所記載的技術方案進行實施。

本發明生產DL-丙氨酸工程菌的構建方法具體包括以大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)XZ-A26CGMCC?No.4036為出發菌株，并將外源的丙氨酸消旋酶基因整合在該菌株染色體上的甲基乙二醛合成酶基因位點。所述外源的丙氨酸消旋酶基因的序列為序列表中序列14，所述甲基乙二醛合成酶基因的序列為自序列表中序列15的5′端第495-953位核苷酸；所述人工調控元件M1-93的序列為序列表中序列17。

本發明生產DL-丙氨酸的工程菌是通過以下操作步驟構建得到；

(a)丙氨酸消旋酶基因的克隆和整合：