[發明專利]一種黃瓜綠斑駁花葉病毒單克隆抗體及試劑盒

有效

• 申請號: 201210581888.3
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN102994455A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 陳西釗;孫明;張麗;馬永纓;遲立超;秦亞嫚
• 申請（專利權）人: 北京世紀元亨動物防疫技術有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/10;G01N33/577;G01N33/558;C12R1/91
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明屬于生物檢測技術，涉及一種黃瓜綠斑駁花葉病毒單克隆抗體及試劑盒。

背景技術

黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber?green?mottle?mosaic?virus，CGMMV），是蕪菁花葉病毒科（Tymoviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）成員。該病毒主要侵染葫蘆科作物，可引起黃瓜、西瓜、甜瓜、葫蘆、筍瓜、無花果、葉瓜等葫蘆科作物葉片黃化畸形、生長緩慢、結果延時、果實大部分黃化變白并產生黑綠色水疤狀的壞死斑，產量損失可高達15%。世界上許多國家和地區將黃瓜綠斑駁花葉病毒列為葫蘆科作物的重要檢疫性病毒。2006年12月，我國將黃瓜綠斑駁花葉病毒確定為全國農業植物檢疫性有害生物，屬國家三類檢疫性病害。

黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）粒子主要分布于植物的葉片、表皮、薄壁組織、木質部、韌皮部及其他各部的細胞質和細胞液泡內。黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的檢測方法有：生物學方法、電子顯微鏡技術、血清學技術、分子生物學技術等。生物學檢測可以確定CGMMV的侵染性、傳播方式和寄主范圍，但所需時間長、工作量大，靠肉眼觀察，穩定性和可靠性不高。電子顯微鏡技術需要很高的硬件要求、專業知識要求，不適用于規模化、現場檢測。

隨著分子生物學的發展與應用，運用分子生物學技術進行CGMMV檢測的方法越來越多，尤其是基于聚合酶鏈式反應（PCR）的反轉錄（RT-）PCR，實時熒光RT-PCR。但是該方法需要昂貴且專業的儀器設備，尤其是實時熒光RT-PCR，所用耗材也價格不菲，操作也是需要經過專業培訓的人員才能勝任，而且樣品及操作容易出現污染而造成假陽性。而基于抗體的捕獲ELISA、膠體金試紙條等方法可以快速、靈敏地檢測CGMMV病毒，適于在大規模的監測系統中應用和現地檢測。而捕獲ELISA、膠體金試紙條等方法的應用依賴于CGMMV病毒的特異性單克隆抗體的研制。

但目前為止，尚未有見靈敏度好、特異性強、效價高的黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV的單克隆抗體的報道。

發明內容

根據上述領域的需求和不足，本發明提供一種靈敏度好、特異性強的黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV的單克隆抗體，本發明單克隆抗體可以應用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒。

一種雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC?No.6958，所述雜交瘤細胞株的獲得是通過將黃瓜綠斑駁花葉病毒毒源接種在葫蘆上制備黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）粒子提純液，并純化的，用將純化的黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）粒子提純液免疫小鼠，取免疫小鼠脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞進行融合，后對上述細胞進行培養，進一步亞克隆，篩選出一株針對黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）粒子的單克隆抗體，及分泌這些單克隆抗體的雜交瘤細胞，純化并保藏。

一種黃瓜綠斑駁花葉病毒單克隆抗體，由上述雜交瘤細胞株分泌而得。

上述單克隆抗體在檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒中的應用。

一種用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的反應載體，其特征在于，所述反應載體上直接或間接包被有上述單克隆抗體。

一種檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的試劑盒，其特征在于，包含有上述的反應載體。所述反應載體是基于免疫反應原理的檢測儀器，可以是熒光化學檢測板、酶聯免疫檢測板等，本發明實施例優選的是酶標板。

一種檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的膠體金試劑盒，其特征在于，在金標纖維墊上包被有膠體金標記的抗CGMMV的單克隆抗體，即Au-McAb；檢測線上包被有兔抗CGMMV多抗，即CGMMV-Pc；檢測時，當樣本中存在CGMMV，則與Au-McAb形成復合物，進而與檢測線的CGMMV-Pc結合，顯色。

本發明試劑盒可以用于鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒，輔助鑒定待測病毒是否為黃瓜綠斑駁花葉病毒以及輔助鑒定待測植物樣本是否感染黃瓜綠斑駁花葉病毒。

本發明提供的單克隆抗體用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒，具有特異性好、敏感性強、效價高等優點。本發明研制的黃瓜綠斑駁花葉病毒單克隆抗體可用于研制黃瓜綠斑駁花葉病毒的免疫學診斷試劑，如酶聯診斷試劑，膠體金免疫試紙條等。

本發明酶聯免疫檢測試劑盒使用雙抗體夾心法檢測標本中的黃瓜綠斑駁花葉病毒抗原。先在試劑盒的聚乙烯微孔板條上預包被兔抗黃瓜綠斑駁花葉病毒粒子的多克隆抗體，當加入的樣品中含有黃瓜綠斑駁花葉病毒時，微孔中預包被的多克隆抗體能將其捕獲，隨后加入的酶標單克隆抗體與之結合，然后通過酶催化底物的顯示程度來判斷結果。當標本中不含黃瓜綠斑駁花葉病毒時，底物不會顯色。可檢測的標本包括種子、葉片等待檢測物的研磨液等。