[發(fā)明專利]共表達(dá)兩個獨(dú)立的抗關(guān)節(jié)炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210581357.4
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN103045646A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于繼云;張巍;王芳;閻瑾琦;王博;張曉郡;徐元基
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/66;C12N7/01;A61K48/00;A61P19/02;A61P29/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.一種共表達(dá)兩個獨(dú)立的抗關(guān)節(jié)炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關(guān)病毒載體，是自上游至下游依次攜帶有TNFR-Fc基因、Furin裂解位點(diǎn)編碼序列、2A自剪切肽編碼序列和CTLA4-FasL基因的重組腺相關(guān)病毒載體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒載體，其特征在于：用于構(gòu)建上述重組腺相關(guān)病毒載體的出發(fā)載體為pAAV2-neo、pAAV2neo-EF1α、pAAV2neo-HRE或pSDAVneo-CAG等AAV2型載體，優(yōu)選為pAAV2-neo，所述TNFR-Fc基因、Furin裂解位點(diǎn)編碼序列、2A自剪切肽編碼序列和CTLA4-FasL基因位于載體pAAV2-neo中CMV啟動子和BGH?polyA尾兩端的反向末端重復(fù)序列(ITR)之間。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組腺相關(guān)病毒載體，其特征在于：所述共表達(dá)兩個獨(dú)立的抗關(guān)節(jié)炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關(guān)病毒載體為TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。

4.一種構(gòu)建權(quán)利要求3所述共表達(dá)兩個獨(dú)立的抗關(guān)節(jié)炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關(guān)病毒載體的方法，包括以下步驟：

1）合成編碼人p75TNFR胞外區(qū)（NCBI?Genebank?No.NM_001066.2）的基因，在合成的人p75TNFR胞外區(qū)基因中自5’端至3’端依次包含有限制性內(nèi)切酶Kpn?I識別位點(diǎn)、Kozak序列、起始密碼ATG、TNFR的原始信號肽、人p75TNFR胞外區(qū)基因、限制性內(nèi)切酶Asc?I和Pac?I識別位點(diǎn)、終止密碼子TGA和限制性內(nèi)切酶EcoR?I識別位點(diǎn)，在引入Asc?I和Pac?I識別位點(diǎn)時為了下游基因的正確編碼，在Asc?I識別位點(diǎn)后加了一個額外的堿基A、在Pac?I識別位點(diǎn)后加了一個額外的堿基G，將此合成的人p75TNFR胞外區(qū)基因命名為(KpnI)Kozak-ATG-s?ignal-TNFR(AscI-PacI)-TGA（EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將該基因克隆入載體pGEM-T中；

2）合成編碼IgG1Fc（NCBI?GenBank:AJ294730.1）的基因，在合成的IgG1Fc基因中自5’端至3’端依次包含有限制性內(nèi)切酶Asc?I識別位點(diǎn)、IgG1Fc基因、6×His標(biāo)簽和限制性內(nèi)切酶Pac?I識別位點(diǎn)，并在Asc?I識別位點(diǎn)后加一個額外的堿基A，在Pac?I識別位點(diǎn)后加了一個額外的堿基G，將此合成的IgG1Fc基因命名為(AscI)IgG1Fc-His(PacI)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，將該基因克隆入載體pGEM-T中；

3）用限制性內(nèi)切酶Kpn?I和EcoR?I將步驟1）合成的人p75TNFR胞外區(qū)基因(KpnI)Kozak-ATG-signal-TNFR(AscI-PacI)-TGA（EcoRI）從載體pGEM-T上切下，將其連接入同樣經(jīng)Kpn?I和EcoR?I雙酶切的載體pAAV2-neo中，得到攜帶人p75TNFR胞外區(qū)基因的重組載體pAAV2/TNFR，然后用限制性內(nèi)切酶Asc?I和Pac?I將步驟2）合成的IgG1Fc基因(AscI)IgG1Fc-His(PacI)從載體pGEM-T上切下，將其連接入同樣經(jīng)Asc?I和Pac?I雙酶切的攜帶人p75TNFR胞外區(qū)基因的重組載體pAAV2/TNFR中，得到攜帶有TNFR-Fc融合基因的重組載體，命名為TRFC，在載體TRFC中，TNFR-Fc融合基因可命名為(KpnI)Kozak-ATG-signal-TNFR-(AscI)IgG1Fc-His(PacI)-TGA（EcoRI)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，TNFR-Fc融合基因的上游為CMV啟動子，下游為BGH?polyA尾，CMV啟動子和BGH?polyA尾的兩端各有一個ITR序列；

4）合成5’端連接有Furin裂解位點(diǎn)氨基酸（RAKA）編碼序列和2A自剪切肽編碼序列的CTLA4-FasL融合基因，在合成的CTLA4-FasL融合基因中自5’端至3’端依次包含有限制性內(nèi)切酶PacI識別位點(diǎn)、Furin裂解位點(diǎn)編碼序列、2A自剪切肽編碼序列、人抑瘤素M信號肽編碼序列、人CTLA4胞外區(qū)基因、人FasL胞外區(qū)基因、Flag標(biāo)簽編碼序列、終止密碼子TGA和限制性內(nèi)切酶EcoR?I識別位點(diǎn)，將此合成的CTLA4-FasL融合基因命名為(PacI)Furin-2A-M

signal-CTLA4-FasL-Flag-TGA(EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列4所示，將該融合基因用限制性內(nèi)切酶Pac?I和EcoR?I酶切后，將其連接入經(jīng)同樣酶雙酶切的TRFC載體中，得到自上游至下游依次攜帶有TNFR-Fc融合基因、Furin裂解位點(diǎn)氨基酸（RAKA）編碼序列、2A自剪切肽編碼序列和CTLA4-FasL融合基因的重組腺相關(guān)病毒載體，命名為TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，在載體TFCF中，TNFR-Fc融合基因的上游為CMV啟動子，CTLA4-FasL融合基因的下游為BGH?polyA尾，CMV啟動子和BGH?polyA尾的兩端各有一個ITR序列。