[發明專利]穩定敲低Mon1A的細胞系及其構建方法

在審

• 申請號: 201210580780.2
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN103898054A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 劉毅;楊詩涵;李紅昌;李華順
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N15/85;C12R1/91
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

技術領域

本發明涉及細胞學領域，尤其涉及一種穩定敲低Mon1A的細胞系及其構建方法。

背景技術

連續的從初級內體向次級內體的轉變需要協調小GTP酶Rab5和Rab7活性。初級內體向次級內體的轉變可能是通過轉運載體也可能是通過內體上丟失Rab5同時獲得Rab7這樣的Rab蛋白的轉變所調控的，在線蟲內的研究證明了后一種的調控方式。此外，后來研究表明在后生動物中SAND-1/Mon1A是Rab蛋白轉變的臨界開關。SAND-1在這一過程中有著雙重的作用。首先，它通過將RABX-5從內吞小體的膜上去除來阻斷對RAB-5活性是正反饋調節；其次，它加倍了對RAB-7的募集，很可能是通過與同一膜上的HOPS復合物相互作用完成。因而SAND-1/Mon1A調控著RAB-5和RAB-7GEFs的分布而成為RAB-5和RAB-7的轉換開關。

胞外物質在細胞膜上的內陷處被包裹從而被吸收進入細胞。這些內陷無論是管狀還是小泡結構都是通過一種分裂方式進而從質膜上釋放到胞內的。這些內吞的產物與初級內體融合，而初級內體是被其所帶有的一種小GTP酶Rab蛋白家族的Rab5以及Rab5效應蛋白（例如EEA1和磷酸肌醇激酶Vps34）所標記的。初級內體也被認為是分選內體，因為蛋白質可以被再循環到質膜，也可以被逮到轉運高爾基網，或是成為溶酶體分解的底物。溶酶體的分選牽涉到轉運蛋白質到次級內體，也相當于多泡體。次級內體被另外一個小GTP酶Rab家族的Rab7所標記。

從初級內體向次級內體轉化的過程因涉及一個關系到Rab5的正反饋調節而十分復雜。Rab5依靠鳥嘌呤核苷酸轉換因子（GEF）Rabex5來啟動隨后的綁定并激活效應分子，如磷酸肌醇激酶Vps34，從而被募集到初級內體上。這樣會依次增加與Rab5和更多效應分子的綁定。后來的研究發現了SAND-1/Mon1A是第一個被發現在Rab蛋白轉換過程中的重要調節器。SAND-1/Mon1A是RAB-5活性是正反饋調節的阻斷劑。不僅如此，SAND-1/Mon1A的活性驅使Rab7被募集到初級內體上，很可能是通過與Rab7的鳥嘌呤轉換因子復合物HOPS相互作用完成的。

因此，SAND-1/Mon1A是初級向次級內體成熟的轉換器。SAND-1/Mon1A在脊椎動物里有兩個同源物，Mon1A和Mon1B。

發明內容

基于此，有必要提供一種穩定敲低Mon1A的細胞系及其構建方法。

一種穩定敲低Mon1A的細胞系，包括真核表達載體，所述真核表達載體包括用于抑制Mon1A表達的序列。

在一個實施例中，所述用于抑制Mon1A表達的序列為SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

在一個實施例中，所述細胞系為MCF-7A細胞系。

在一個實施例中，所述真核表達載體為pLKO.1質粒。

在一個實施例中，所述用于抑制Mon1A表達的序列插入到所述pLKO.1質粒的AgeⅠ和EcoRⅠ兩個酶切位點之間。

一種穩定敲低Mon1A的細胞系的構建方法，包括如下步驟：

構建包括用于抑制Mon1A表達的序列的真核表達載體；

將所述包括用于抑制Mon1A表達的序列的真核表達載體轉染到細胞中，得到所述穩定敲低Mon1A的細胞系。

在一個實施例中，所述用于抑制Mon1A表達的序列為SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

在一個實施例中，所述細胞系為MCF-7A細胞系。

在一個實施例中，所述真核表達載體為pLKO.1質粒。

在一個實施例中，所述用于抑制Mon1A表達的序列插入到所述pLKO.1質粒的AgeⅠ和EcoRⅠ兩個酶切位點之間。

這種穩定敲低Mon1A的細胞系，通過抑制Mon1A的mRNA的轉錄，以明顯降低Mon1A的蛋白表達量。該穩定表達細胞系的建立，不僅成功在體外模擬了乳腺癌細胞Mon1A的表達狀態為研究Mon1A在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也為Mon1A的功能的研究提供了幫助。

附圖說明

圖1為原始的pLKO.1質粒的圖譜；

圖2為一實施方式的穩定敲低Mon1A的細胞系的構建方法的流程圖；

圖3為western檢測MCF-7A?Mon1A?knock-down穩定細胞系蛋白表達量的結果圖。

具體實施方式