[發明專利]TALE重復單元四聚體庫的構建方法、TALEN表達載體的構建方法及其應用

無效

• 申請號: 201210580350.0
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103146735A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 張智英;張志強;李鐸;辛穎;麻麗霞;王昕;張濤;徐華榮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C40B40/02;C40B50/06;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.TALE重復單元四聚體庫的構建方法，包括下述步驟：

(1)、PCR擴增TALE單個重復單元：以TALE單個重復片段monomer?NI為模板，用TALE-F1/TALE-R1為引物PCR擴增得到TALE單體NI1、NI2、NI3、NI4；以TALE單個重復片段monomer?NG為模板，用TALE-F2/TALE-R2為引物PCR擴增得到TALE單體NG1、NG2、NG3、NG4；以TALE單個重復片段monomer?HD為模板，用TALE-F3/TALE-R3為引物PCR擴增得到TALE單體HD1、HD2、HD3、HD4；以TALE單個重復片段monomer?NN為模板，用TALE-F4/TALE-R4為引物PCR擴增得到TALE單體NN1、NN2、NN3、NN4，其中monomer?NI識別A堿基、monomer?NG識別T堿基、monomer?HD識別C堿基、monomer?NN識別G堿基；

(2)、將步驟(1)構建所得的TALE單體插入線性化pGEM-T?easy載體中，得到相應的16個TALE單體質粒pGEM-T-NI1、pGEM-T-NI2、pGEM-T-NI3、pGEM-T-NI4、pGEM-T-NG1、pGEM-T-NG2、pGEM-T-NG3、pGEM-T-NG4、pGEM-T-HD1、pGEM-T-HD2、pGEM-T-HD3、pGEM-T-HD4、pGEM-T-NN1、pGEM-T-NN2、pGEM-T-NN3和pGEM-T-NN4；

(3)、在T4DNA連接酶緩沖液中加入TALE單體質粒，同時加入BsaI內切酶和T4DNALigase進行酶切-連接反應，所述TALE單體質粒為pGEMT-Momomer1，pGEMT-Monomer2，pGEMT-Monomer3和pGEMT-Monomer4，得到含256個四聚體質粒的TALE重復單元四聚體庫，其中pGEMT-Momomer1為pGEM-T-NI1、pGEM-T-HD1、pGEM-T-NG1或pGEM-T-NN1中的一個，pGEMT-Monomer2為pGEM-T-NI2、pGEM-T-HD2、pGEM-T-NG2或pGEM-T-NN2中的一個，pGEMT-Monomer3為pGEM-T-NI3、pGEM-T-HD3、pGEM-T-NG3或pGEM-T-NN3中的一個，pGEMT-Monomer4為pGEM-T-NI4、pGEM-T-HD4、pGEM-T-NG4或pGEM-T-NN4中的一個。

2.根據權利要求1所述的TALE重復單元四聚體庫的構建方法，其特征在于，步驟(1)中PCR擴增的體系為模板1μL、正向引物1μL、反向引物1μL、10×Taq?Buffer?5μL、2.5mmol/L?dNTPs?4μL、Taq?DNApolymerase?0.5μL和H₂O?37.5μL；PCR擴增的反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，擴增30個循環；72℃延伸10min。

3.根據權利要求1所述的TALE重復單元四聚體庫的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中TALE單體插入線性化pGEM-T?easy載體中的具體步驟為TALE單體與末端含T堿基的線性化pGEM-T?easy載體連接，連接體系為線性化pGEM-T?easy載體1μL、TALE單體1μL、10×T₄DNA酶Buffer?1μL、T₄連接酶1μL和H₂O?6μL。

4.根據權利要求1所述的TALE重復單元四聚體庫的構建方法，其特征在于，步驟(3)中的酶切-連接反應體系為pGEMT-Momomer12μL、pGEMT-Momomer22μL、pGEMT-Momomer32μL、pGEMT-Momomer42μL、10×T₄DNA酶Buffer?2μL、BsaI?0.5μL、T₄連接酶0.5μL和H₂O?9μL；反應條件為首先37℃5min，16℃5min，循環30次；16℃10h；65℃20min。