[發(fā)明專利]一種活性發(fā)酵液及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210580253.1
• 申請(qǐng)日: 2012-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN103013888A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李國紅;盧皓;張克勤;王芯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A01N63/02;A01P5/00;C12R1/025
• 代理公司: 昆明今威專利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種活性發(fā)酵液及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù):

線蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的傳染性病原之一，使作物減產(chǎn)從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失。目前對(duì)線蟲的防治有多種方法，但主要以化學(xué)殺線劑為主。由于化學(xué)殺線劑的高毒、高殘留對(duì)人類健康及環(huán)境造成潛在威脅，因此生物殺線劑成為線蟲防治的一個(gè)研究方向。微生物由于易培養(yǎng)，生長周期短，因此利用微生物及其代謝產(chǎn)物防治線蟲受到人們的關(guān)注。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis?elegans）和全齒復(fù)合線蟲（Panagrellus?redivivus）易培養(yǎng)和觀察，體形大，對(duì)環(huán)境條件敏感，在室內(nèi)研究中常用其作為指示線蟲。南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne?incognita）是危害最為嚴(yán)重的植物病原線蟲之一，所引起的病害是一種極難防治的土傳性病害。

發(fā)明內(nèi)容:

本發(fā)明的目的在于提供一種活性發(fā)酵液及其應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

1、活性發(fā)酵液的制備：

本發(fā)明使用的細(xì)菌菌株為無色桿菌（Achromobacter?sp.）CD-253，該菌株已于2012年7月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)?中國科學(xué)院微生物研究所；保藏號(hào)：CGMCC?No.?6358。

無色桿菌（Achromobacter?sp.）CD-253保存在酵母提取物胰蛋白胨(LB)培養(yǎng)基（酵母提取物：5.0?g,?胰蛋白胨：10.0?g,?氯化鈉：10.0?g,?水1000?ml,?pH：7.0）中，使用時(shí)在LB液體培養(yǎng)基中活化24小時(shí)。將活化后菌種100?μl接種于裝有50?ml-250?ml液體LB培養(yǎng)基三角瓶中，在溫度為28℃-37℃，轉(zhuǎn)速為120-180?rpm的條件下培養(yǎng)96小時(shí)，即可得到培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液8000?rpm離心10分鐘后，取上清放入4℃的冰箱中備用。這樣就得到本發(fā)明的活性發(fā)酵液。

2、制備試驗(yàn)用的秀麗隱桿線蟲（C.?elegans）、全齒復(fù)合線蟲（P.?redivivus）和南方根結(jié)線蟲（M.?incognita）：

燕麥培養(yǎng)基用于秀麗隱桿線蟲（C.?elegans）和全齒復(fù)合線蟲（P.?redivivus）培養(yǎng)；燕麥片10?g，水10?ml?浸潤燕麥片，混勻后加入到50?ml?三角瓶中，120℃高溫滅菌20?min。在超菌工作臺(tái)中按無菌操作在燕麥片培養(yǎng)基中接入線蟲，接種后的三角瓶放置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天后，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)將載有線蟲的培養(yǎng)基在無菌條件下，挑取適量已培養(yǎng)好的含線蟲的燕麥于擦鏡紙上，用簡易貝曼漏斗法洗出線蟲，用無菌水制成線蟲懸液備用（每毫升1000條左右）。

番茄根系用于南方根結(jié)線蟲（M.?incognita）的制備。取發(fā)病嚴(yán)重的番茄根系，洗凈后統(tǒng)計(jì)根結(jié)數(shù)量，放入水中浸泡過夜，收集浸泡液；同法再泡洗3次，棄去根系。殘液和泥土經(jīng)2000?rpm離心2?min，棄去上清液，加入494?g/L蔗糖，混勻后2000?rpm離心2?min，將上清液用800目的分離篩清洗，收集分離篩上的幼蟲和蟲卵。洗液再用100、200和500目的分離篩反復(fù)漂洗，收集500目分離篩上的收集物-大部分為蟲卵；500目分離篩上的濾過液再經(jīng)800目的分離篩清洗，收集分離篩上的蟲體-2齡幼蟲。所分離的蟲和蟲卵儲(chǔ)于4℃的冰箱中備。

3?實(shí)驗(yàn)方法

液體浸泡法：取5?ml測試樣品溶液、200?μl約含有200條線蟲的懸液于直徑為6?cm的培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后將培養(yǎng)皿室溫放置。在解剖鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野定時(shí)（1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)）進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)病蟲數(shù)（以線蟲不動(dòng)作為標(biāo)準(zhǔn)）和總線蟲數(shù)。每個(gè)測試樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，并以未接種菌株的培養(yǎng)基為對(duì)照，得到測試樣品對(duì)線蟲的致死率，以致死率高低評(píng)定樣品對(duì)線蟲的毒力。

本發(fā)明的活性發(fā)酵液在制備毒殺南方根結(jié)線蟲（M.?incognita）、秀麗隱桿線蟲（C.?elegans）、及全齒復(fù)合線蟲（P.?redivivus）生物制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有制備方法簡單，高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，能夠作為制備生物農(nóng)藥殺線劑的應(yīng)用。

具體實(shí)施方式：

下面用實(shí)施例來進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

實(shí)施例一?：