[發明專利]一種雙鳥苷酸環化酶基因、載體、工程菌及其應用

在審

• 申請號: 201210579844.7
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN104152472A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 陶飛;劉小杰;陳禮明
• 申請（專利權）人: 陶飛
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N1/20;C12N15/63;C12P19/36;C12R1/64
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

(一)技術領域

本發明涉及一種編碼雙鳥苷酸環化酶基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉化得到的重組工程菌、及在制備雙鳥苷酸環化酶和生物合成c-di-GMP方面的應用。?

(二)背景技術

環鳥苷二磷酸(c-di-GMP)作為細菌第二信號分子，普遍存在于各種微生物中，包括對人類有害的病原菌。在這些微生物中，c-di-GMP調控著毒力因子的表達，生物膜的形成，抗生素的耐藥性(ref.in?Qinghua)。在急性與慢性細菌引起的感染與疾病中，c-di-GMP有著非常重要的作用。因此c-di-GMP具有良好的藥物開發前景。?

已經有四個專利公開了c-di-GMP的應用價值。W02005/030186發現c-di-GMP可以減弱微生物病原菌的毒性，抑制或減少微生物病原菌的定居。US2005/0203051發現c-di-GMP可以抑制癌細胞增殖或增加癌細胞凋亡。US2006/0040887發現c-di-GMP可以刺激或者增強病人的免疫反應，可以作為疫苗的佐劑來增強病人對疫苗的免疫反應。EP1782826也描述了c-di-GMP可以作為疫苗的佐劑及其在藥物組合物(如疫苗)中的用途。?

針對c-di-GMP所進行的研究是新型藥物開發中的一個熱點。國內外大量的研究機構正在努力闡明c-di-GMP信號傳導機制，開發c-di-GMP新的應用價值。要使得上述的研究順利進行，必須要有足夠量的c-di-GMP提供。因此大量合成c-di-GMP具有十分重要的意義。?

目前已有報道的主要是化學合成方法。在整個合成反應中，要使用大量的保護基團，增加了生產成本。同時正常存在以下問題：產率較低，反應劇烈，有環境污染。用酶法合成，工藝簡單，成本低.且無需有機試劑及環境污染問題。為此構建具有工業用途的雙鳥苷酸環化酶基因工程菌，并用這種工程菌來大規模工業化生產c-di-GMP，具有意義重大。?

(三)發明內容

本發明目的是提供一種雙鳥苷酸環化酶基因及其重組表達載體、基因工程菌，及其在制備雙鳥苷酸環化酶和生物轉化c-di-GMP方面的應用。?

本發明采用的技術方案是：?

一種雙鳥苷酸環化酶基因，具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。?

為獲取目標基因片段，本發明所用菌種的生物材料來源于中國典型培養物保藏中心，具有如下特征：?保藏分類命名：野油菜黃單胞菌Xcc1635Rif^r/Xanthomonas?campestris?Xcc1635Rif^r。保藏編號：CCTCC?NO：M2012464。保藏日期：2012年11月20號。保藏單位：中國典型培養物保藏中心。保藏單位地址：武漢.武漢大學.430072。?

該雙鳥苷酸環化酶基因序列由如下方法獲得：利用PCR技術在引物1(GACTCTAGAACTTCACGACGAGAAGCTGGCGGTAG)、引物2(GACTCTAGAACCCATAATGGATAGGCAC)的作用下，以來源于野油菜黃單胞菌(Xanthomonas?campestris)菌株CCTCC?NO：M2012464中的總基因組DNA為模板，克隆得到約1.1kb的雙鳥苷酸環化酶的基因片段。將該片段連接到pDSK519載體上，獲得克隆載體pDSK-dgcX。對重組質粒進行測序，并利用軟件對測序結果進行分析，分析表明該序列含有一個長為1026bp的開放閱讀框。改基因核苷酸序列為(SEQ?ID?NO：1)：?

利用軟件對該基因序列進行分析，推知所述雙鳥苷酸環化酶基因編碼SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列：?

本發明還涉及含有所述雙鳥苷酸環化酶基因的重組載體，以及利用所述載體轉化得到的重組基因工程菌。?

本申請發明人根據測序結果設計表達引物3(CACGGATCCTTGCCACACATCGAGGCCTGGAGCATCA)和引物4(CAGCTCGAGTCAAGAAATAGCCATACC)，以重組質粒pDSK-dgcX為模板，通過PCR擴增得到了用于表達的雙鳥苷酸環化酶基因。本發明雙鳥苷酸環化酶基因同表達載體pGEX-6p-1連接，構建了含有雙鳥苷酸環化酶基的表達重組載體pGEX-6p-dgcX。?