[發(fā)明專利]一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的奇異變形桿菌及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210578423.2
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN103045514A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 陳堅;堵國成;方芳;張繼冉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/18;C12N9/06;A62D3/02;C12R1/01;A62D101/28
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發(fā)明一株奇異變形桿菌及其應用，特別是一株產酸性氨基甲酸乙酯水解酶的奇異變形桿菌的篩選鑒定及其粗酶提取物降解氨基甲酸乙酯特性的研究。?

背景技術

氨基甲酸乙酯(Ethyl?Carbamate,EC)，在醫(yī)學上有重要用途，曾一度被用作治療多發(fā)性骨髓瘤及慢性骨髓性白血病，以及作為麻醉劑使用。近年研究發(fā)現(xiàn)，氨基甲酸乙酯是一種人類潛在致癌物質，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，國際癌癥研究機構在2007年把氨基甲酸乙酯列為2A類致癌物。氨基甲酸乙酯是一種伴隨發(fā)酵食品（如酒精飲料、豆醬、醬油等）的生產過程中產生的副產物，對食品安全和生物體健康都有著嚴重的影響和危害。面對氨基甲酸乙酯所造成的食品安全問題，以微生物及酶降解實現(xiàn)食品中氨基甲酸乙酯的無危害化，是較理想的解決方案。?

奇異變形桿菌(Proteus?mirabilis)廣泛存在于水、土壤腐敗的有機物以及人和動物的腸道中。在腸道中一般不致病。能迅速分解尿素。此屬細菌的O抗原與某些立克次體的部分抗原有交叉，可替代立克次體抗原與患者血清作凝集反應，此反應稱為外斐試驗，用于某些立克次體病的輔助診斷。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）SW03，已于2012年10月19日保藏于中國典型微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CCTCC?M2012416,保藏地址為中國武漢武漢大學。菌體的形態(tài)學特征為菌落圓形，表面干燥光滑，邊緣規(guī)則，培養(yǎng)時間小于3天菌落為透明，大于三天培養(yǎng)菌落為黃色半透明，菌落大小0.2-0.5mm,可用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基通氣培養(yǎng)或用MRS培養(yǎng)基厭氧靜置培養(yǎng)。菌體革蘭氏陰性，有莢膜，1000×顯微鏡下觀察細胞呈短桿狀，見附圖1。?

所述奇異變形桿菌分離自成年雌性小鼠胃部，其保藏條件如下：從生長良好的平板上挑取單菌落轉接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在30℃，200rpm，培養(yǎng)16h，取500μL培養(yǎng)液移入含有500μL40%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。?

上述的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為二型營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化鈉5g，蒸餾水1L，如需固體培養(yǎng)基，再添加2%瓊脂。?

本發(fā)明的另一個目的是提供上述奇異變形桿菌粗酶液的提取方法。?

本發(fā)明的另一個目的是提供上述奇異變形桿菌的應用，其合成的酸性氨基甲酸乙酯水解酶可以在pH小于5的條件下快速分解發(fā)酵食品中的副產物氨基甲酸乙酯并產生乙醇和氨氣。?

本發(fā)明的另一個目的是提供上述奇異變形桿菌在酸性環(huán)境下分解尿素的應用，其合成的酸性脲酶可以在pH小于5的條件下快速分解發(fā)酵食品中的副產物尿素并產生二氧化碳和氨氣以及其脲酶活性的檢測方法。?

本發(fā)明提供的奇異變形桿菌能合成氨基甲酸乙酯水解酶以及脲酶，在pH4.8時具有最高酶活，能在酸性條件下快速分解氨基甲酸乙酯以及尿素。在pH為4.8的條件下，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活為11.7U/g，脲酶酶活為10.2U/g。?

說明書附圖?

圖1奇異變形桿菌Proteus?mirabilis顯微照片?

圖2pH對奇異變形桿菌氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響?

具體實施方式

實施例1：奇異變形桿菌篩選方法?

將25g每只5周大雌性昆明小鼠進行五天的強飼氨基甲酸乙酯溶液(200mg/kg?body?weight/day)后解剖，并用濃度為0.9%的生理鹽水沖洗小鼠胃腸道組織，取組織懸浮液1mL于1000×g下離心10min，取上清液接種于富集培養(yǎng)基中（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯10g，水1000mL，pH7.0），30℃下通氣培養(yǎng)20h。培養(yǎng)液于2000×g離心5分鐘，取上清涂布于篩選培養(yǎng)基（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯30g，瓊脂20g，水1000mL，pH5.0）中培養(yǎng)三天。挑選菌落形態(tài)較大的菌株轉移到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h后進行保藏。?