[發(fā)明專利]一株合成耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶的糞腸球菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210578408.8
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN103060232A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳堅;堵國成;方芳;張繼冉
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/18;C12H1/15;A23L1/015;C12R1/01
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種糞腸球菌及其應(yīng)用，特別是一種能合成耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶的糞腸球菌及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

氨基甲酸乙酯(Ethyl?Carbamate,EC)，在醫(yī)學(xué)上有重要用途，曾一度被用作治療多發(fā)性骨髓瘤及慢性骨髓性白血病，以及作為麻醉劑使用。近年研究發(fā)現(xiàn)，氨基甲酸乙酯是一種人類潛在致癌物質(zhì)，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)在2007年把氨基甲酸乙酯列為2A類致癌物。氨基甲酸乙酯是一種伴隨發(fā)酵食品（如酒精飲料、豆醬、醬油等）的生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，對食品安全和生物體健康都有著嚴(yán)重的影響和危害。面對氨基甲酸乙酯所造成的食品安全問題，以微生物及酶降解實現(xiàn)食品中氨基甲酸乙酯的無危害化，是較理想的解決方案。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株合成耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶的糞腸球菌(Enterococcus?faecals)SW08，已于2012年10月19日保藏于中國典型微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CCTCC?M2012417，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。菌落為白色圓形，表面干燥光滑，邊緣規(guī)則，不透明，菌落大小1-2mm，兼性厭氧或厭氧，可用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基通氣培養(yǎng)或用MRS培養(yǎng)基厭氧靜置培養(yǎng)。菌體革蘭氏陽性，有莢膜，1000×顯微鏡下觀察細(xì)胞呈球形。?

所述糞腸球菌分離自成年雌性小鼠胃腸道，其保藏條件如下：從生長良好的平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在30℃，200rpm，培養(yǎng)16h，取500μL培養(yǎng)液移入含有500μL40%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。?

上述的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為二型營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化鈉5g，蒸餾水1L，如需固體培養(yǎng)基，再添加2%瓊脂。?

本發(fā)明的另一個目的是提供上述糞腸球菌粗酶液的提取方法。?

本發(fā)明的另一個目的是提供上述糞腸球菌的應(yīng)用，其合成的耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶可以在NaCl濃度大于15%的條件下的條件下快速分解發(fā)酵食品中的副產(chǎn)物氨基甲酸乙酯并產(chǎn)生乙醇和氨氣。其在最適pH7.0時具有最高酶活11U/g，在NaCl濃度大于15%的條件下，?紡錘形賴氨酸芽孢桿菌所產(chǎn)生的耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶能夠保持40%的酶活。?

本發(fā)明提供的糞腸球菌能合成耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶，在pH為7.0時具有最高酶活，能在高滲條件下快速分解氨基甲酸乙酯。在pH為7.0的條件下，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活為11U/g，在NaCl濃度大于15%的條件下，其能保持40%的氨基甲酸乙酯水解酶酶活。?

附圖說明

圖1糞腸球菌顯微照片?

圖2pH對糞腸球菌氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響?

圖3糞腸球菌氨基甲酸乙酯水解酶對NaCl的耐受性?

具體實施方式

實施例1：糞腸球菌篩選方法?

將25g每只5周大雌性昆明小鼠進(jìn)行五天的強(qiáng)飼氨基甲酸乙酯溶液(200mg/kg?body?weight/day)后解剖，并用濃度為0.9%的生理鹽水沖洗小鼠腸道組織，取組織懸浮液1mL于1000×g下離心10min，取上清液接種于富集培養(yǎng)基中（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g，氨基甲酸乙酯10g，水1000mL，pH7.0），30℃下通氣培養(yǎng)20h。培養(yǎng)液于2000×g離心5min，取上清涂布于篩選培養(yǎng)基（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯30g，瓊脂20g，水1000mL，pH5.0）中培養(yǎng)三天。挑選菌落形態(tài)較大的菌株轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h后進(jìn)行保藏。?

挑取-80℃保藏的菌株在營養(yǎng)肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線，于37℃培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床培養(yǎng)24h，離心5min(12000rpm,4℃)后收集菌體，再用pH7.0的磷酸鹽緩沖液重懸浮菌體至0.1g/mL。通過超聲破碎進(jìn)行酶粗提液的提取，對粗酶液進(jìn)行氨基甲酸乙酯水解酶酶活測定檢測到一株具有氨基甲酸乙酯水解酶活性的菌株，通過16S?rDNA序列分析可知該菌株為一株糞腸球菌，已于2012年10月19日保藏于中國典型微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CCTCC?M2012417，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。?

實施例2：糞腸球菌中氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的提取方法?