[發(fā)明專利]一種提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210577803.4
• 申請(qǐng)日: 2012-12-27
• 公開（公告）號(hào): CN103013951A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏小樂;辛瑜;陳金花;張玲;王武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提取純化植物脂肪酶的方法，特別是指純化小麥胚芽脂肪酶的方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

????脂肪酶（EC?3.1.1.3）是一種重要的水解酶類，在食品、藥品、化工等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。脂肪酶種類很多，其中絕大多數(shù)來自于微生物，少數(shù)來自于動(dòng)物，而極少數(shù)來自于植物。小麥胚芽脂肪酶是一種存在于小麥中的脂肪酶，由于其熱穩(wěn)定性以及在小麥發(fā)芽中的重要性，為大家所關(guān)注。一般認(rèn)為小麥胚芽當(dāng)中富含多種酶類，有α-淀粉酶、脂肪酶、酯酶、脂肪氧化酶和蛋白酶等，其中主要是脂肪酶以及酯酶；尤其是在發(fā)芽后所顯示的酶活主要是脂肪酶酶活。

小麥胚芽脂肪酶的存在對(duì)小麥胚芽的保藏是十分不利的，它能短時(shí)間內(nèi)水解油脂，使其脂肪酸值大幅度升高,?引起麥胚酸敗變質(zhì)；同時(shí)，微生物生長繁殖快，也會(huì)導(dǎo)致麥胚出現(xiàn)結(jié)塊、霉變和發(fā)酵等變質(zhì)現(xiàn)象。所以，目前對(duì)小麥胚芽脂肪酶的研究大多集中在該酶在小麥胚芽中穩(wěn)定性以及如何快速降低其水解活性，防止麥胚酸化變質(zhì)。對(duì)小麥胚芽脂肪酶用于催化生物反應(yīng)過程研究相對(duì)較少，主要集中在手性拆分和油脂工業(yè)方面。據(jù)報(bào)道，小麥胚芽脂肪酶在立體選擇性方面并不符合Kazlauskas規(guī)則，呈現(xiàn)為反K氏規(guī)則，是現(xiàn)有唯一天然來源的反K氏規(guī)則的脂肪酶，這在手性拆分和脂肪酶催化分子機(jī)理解析方面具有重要的意義。在油脂催化方面，目前認(rèn)為，小麥胚芽脂肪酶對(duì)短鏈的甘油三酯具有較好的催化作用?？傮w而言，相對(duì)于其它脂肪酶，小麥胚芽脂肪酶具有來源廣泛，可以從小麥加工廢棄物麥胚中提取獲得，如能利用，將能獲得一種質(zhì)優(yōu)價(jià)廉適合大宗油脂產(chǎn)品加工的脂肪酶。

相較微生物來源脂肪酶，小麥胚芽脂肪酶是植物脂肪酶，植物中含有多種色素、雜蛋白和糖類物質(zhì)等，因此分離純化特別困難；而小麥胚芽脂肪酶粗酶具有穩(wěn)定性差和專一性差等缺點(diǎn)，因此如不分離純化將會(huì)限制了小麥胚芽脂肪酶的進(jìn)一步應(yīng)用。

長期以來，硫酸銨沉淀、透析、離子交換和凝膠層析等傳統(tǒng)方法被用于小麥胚芽脂肪酶的提取與制備。總體而言，由于粗酶中雜質(zhì)較多，各自的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)各不相同，目前尚無成熟的分離純化小麥胚芽脂肪酶的報(bào)道。因此需要提供一種快速分離純化小麥胚芽脂肪酶的方法，以達(dá)到高回收率，收獲高純度的小麥胚芽脂肪酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服小麥胚芽脂肪酶粗酶穩(wěn)定性差和專一性差的缺點(diǎn)，提出一種高效提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法。該方法通過設(shè)計(jì)合成一種親和配體，輔以常見的分離手段，經(jīng)過簡單的幾步反應(yīng)就達(dá)到了分離純化的目的。在分離純化過程中，反應(yīng)條件溫和，所用試劑毒性均較低，對(duì)人體和環(huán)境危害小，易于放大。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法，具體包括如下幾個(gè)步驟：

（1）高效提取粗酶：將小麥胚芽機(jī)械粉碎至100目，然后用含有Triton?X-100，吐溫-20，吐溫-80或SDS中的一種表面活性劑的磷酸鈉緩沖液；以小麥胚芽︰緩沖液質(zhì)量比0.3-1︰1混合，其中磷酸鈉緩沖液pH=7.0，混合振蕩30min，控制與混合液質(zhì)量比1︰1加入正己烷溶解除油，12000rpm室溫離心10min后取上清，得粗酶液。

（2）硫酸銨沉淀和濃縮：將提取的粗酶液邊攪拌邊加入固體硫酸銨，使其中硫酸銨濃度為10%-15%，搖勻后靜置，然后在轉(zhuǎn)速4000rpm下離心10min，棄去上清，將蛋白質(zhì)沉淀用蒸餾水溶解得到鹽析液，回收率大于90%，純化倍數(shù)1.40；選用過濾分子量為10000－15000Da的超濾膜對(duì)脂肪酶鹽析液進(jìn)行濃縮，獲得超濾液。

（3）離子交換層析：采用DEAE-sepharose，DEAE-纖維素，Q-sepharose或superQ-sepharose中的一種離子交換柱層析純化步驟（2）所得超濾液中的脂肪酶，較佳的采用DEAE-sepharose或Q-sepharose；

裝柱后并用緩沖液平衡；將超濾液上樣，上樣量為柱體積的2－3倍，以含有1mol/L的NaCl的pH?8的0.05?mol/L磷酸鈉緩沖液線性或梯度洗脫，流速為?1-5?mL/min，出現(xiàn)兩個(gè)洗脫峰；收集活性峰，用透析袋濃縮。

（4）合成親和介質(zhì)：小麥胚芽脂肪酶親和配體是苯甲嘧啶、胞嘧啶或精氨酸中的一種；層析介質(zhì)是Sepharose、殼聚糖、硅膠或陶瓷顆粒中的一種，較佳的采用Sepharose或硅膠；

小麥胚芽脂肪酶親和配體和由環(huán)氧氯丙烷活化后的層析介質(zhì)通過和乙二胺、1,3-丙二胺、2-羥基-1,3丙二胺、1,4-丁二胺、1,6-己二胺中的一種作為間隔臂進(jìn)行連接，合成親和介質(zhì)；?