[發明專利]DNA-殼聚糖復合納米顆粒、其制備及應用

無效

• 申請號: 201210575641.0
• 申請日: 2012-12-26
• 公開（公告）號: CN103893754A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 萬曉春;田永帥;馬軼凡;蔡林濤
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K47/36;A61K47/34;A61P37/02
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 宋鷹武

【技術領域】

本發明涉及新型免疫佐劑，具體涉及一種DNA-殼聚糖復合納米顆粒、其制備方法，及作為免疫佐劑應用。

【背景技術】

目前不斷開發出的新型疫苗具有良好的抗原特異性和低毒性，但疫苗免疫原性較差。盡管已成功制備得到很有希望的抗原，卻并不能誘導出足夠強的預防作用。例如，可溶性純化蛋白質疫苗或蛋白質亞單位疫苗的免疫激活作用通常較弱，不足以刺激機體產生足夠抗體；單獨應用時所需抗原量較多，機體產生的抗體量較少；且還易引起免疫耐受。但這些疫苗在與較匹配佐劑連用時，以上缺點就會有所改善。因此開發安全有效的免疫佐劑來輔助增強疫苗效力，對于更多新型疫苗在臨床上的成功應用具有重要意義。

佐劑的作用方式多種多樣，人們對其與免疫系統間相互作用的知識也正在逐漸豐富，并已經成為現代免疫學的重要組成部分。分別從事佐劑研究，對于深入理解佐劑作用機理和機體免疫調節方式很有意義。

免疫佐劑可輔佐免疫原刺激機體產生較早、較強、持久的免疫應答。理想的免疫佐劑應該能滿足以下條件：（1）在有效劑量內無毒或毒性極小；（2）能刺激機體產生強大的體液免疫和/或細胞免疫應答；（3）具有持久的免疫力；（4）不誘導自身免疫；（5）無致突變、致癌、致畸形作用等。雖然現在已有許多佐劑應用于動物，但還沒有哪一種佐劑能完全滿足以上要求。

近年來，隨著第2、3代疫苗的迅速發展，特別是多肽疫苗呈現出的極大發展空間，促使免疫佐劑也有了長足的進步。

目前通過FDA批準的能用于人的佐劑鋁膠佐劑存在兩方面主要缺點：其一，只能激發機體產生體液免疫，不能誘導細胞免疫。而細胞免疫對機體細胞內寄生病原體(病毒、原蟲等)及腫瘤免疫力的產生尤為必要。其二，鋁膠佐劑對人免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）、單純皰疹病毒（HSV）、流感病毒，以及血吸蟲病、百日咳和傷寒等抗原沒有免疫佐劑性效果。因此已遠遠不能滿足新型疫苗發展的要求。

納米技術是一門具有廣闊前景的新興技術，納米技術與免疫技術相結合的產物-納米佐劑已成為了當前疫苗研究的熱點。從免疫學觀點來看，納米佐劑均勻性好，包裹或吸附的抗原顆粒正是巨噬細胞（M5）和樹突狀細胞（DC）的首選吞噬目標，這為實現機體有效的免疫反應完成了重要的一步。而且納米佐劑與多肽抗原或DNA疫苗連接后，可以避免常規佐劑載體效應的發生，起到保護抗原的作用。

【發明內容】

本發明旨在克服現有技術的以上缺陷，提供新型DNA-殼聚糖復合納米顆粒的免疫佐劑。

具體地，本發明一方面提供一種DNA-殼聚糖復合納米顆粒，為殼聚糖增溶衍生物包裹的含有AS4短發夾序列的重組質粒，所述AS4短發夾序列為通過環狀序列連接的SEQ?NO.1所示序列與其互補序列。

所述殼聚糖增溶衍生物可以為殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物。

所述環狀序列可以為TCAAGAG序列。

所述重組質粒的大小可以為4610bp。

所述納米顆粒的粒徑可以為35-50nm。

所述殼聚糖增溶衍生物與所述重組質粒的的包被比例為摩爾比20:1。

本發明另一方面提供用于制備該納米顆粒的方法，包括以下步驟：

S1合成AS短發夾序列，并退火；

S2將經退火的AS短發夾序列與雙酶切線性質粒、DNA連接酶在連接緩沖液中混合，轉化感受態大腸桿菌，接種于含氨芐抗性的LB培養基，做抗性篩查，選取抗性菌落，得到重組質粒溶液；以及

S3將殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質粒溶液混合，得到DNA-殼聚糖復合納米顆粒溶液。

步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液的pH可以為5.5。

步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質粒溶液在混合前，可以分別于65℃恒溫5分鐘。

本發明再一方面提供該納米顆粒作為免疫佐劑的應用。

本發明的納米顆粒免疫佐劑均勻性好；可誘導細胞免疫；細胞毒性小；可快速有效地降低抑炎因子IL-10的表達；通過納米顆粒包括技術，在細胞中具有緩釋效應，且能保護DNA免于被細胞內核酸內切酶降解。

【附圖說明】

圖1示出根據本發明實施例的重組質粒的凝膠電泳檢測結果。

圖2為根據本發明實施例的納米顆粒的掃描電鏡圖像。

圖3示出根據本發明實施例的納米顆粒的凝膠阻滯電泳檢測結果。

圖4示出本發明的納米顆粒在降低抑炎因子IL-10表達上的作用。

【具體實施方式】