[發(fā)明專利]一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210575580.8
• 申請(qǐng)日: 2012-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN103060445A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪虹;陳明杰;鮑大鵬;馮愛萍;薛承琴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá)

1.一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，包括：

（1）比較草菇單孢分離菌株交配型A位點(diǎn)的基因序列，分析序列的保守性，針對(duì)草菇不同的單孢分離株分別設(shè)計(jì)特異性引物并合成；

（2）將上述草菇單孢菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基，32~34℃培養(yǎng)；挑取草菇菌絲，利用試劑盒檢測(cè)菌株交配型基因類型；

（3）把上述已確定交配型基因類型的草菇單孢菌株分別接種PDA平板培養(yǎng)基上，32~34℃下培養(yǎng)5~7d，在菌絲生長(zhǎng)的部位打孔，把不同的單孢菌株兩兩接種在PDA平板培養(yǎng)基上，相距1厘米，32~34℃培養(yǎng)，兩個(gè)菌落相交時(shí)，分別從兩個(gè)菌落的外側(cè)挑取菌塊轉(zhuǎn)移到PDA試管培養(yǎng)基上，32~34℃培養(yǎng)，3次繼代培養(yǎng)；

（4）采用步驟（1）中的交配型基因的特異性引物對(duì)草菇雜交獲得的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，草菇雜交菌株能擴(kuò)增出針對(duì)兩個(gè)母本的交配型基因的兩條條帶，單孢菌株只能擴(kuò)增出一條條帶，即可篩選出草菇雜交菌株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，其特征在于：所述步驟（1）中的草菇單孢分離菌株交配型為A1或A2，A位點(diǎn)的基因序列分別如SEQ?ID?No.1所示或如SEQ?ID?No.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，其特征在于：所述A1對(duì)應(yīng)的特異性引物為A1F：AGGGCATTCCAACCTATTCGCTTTC；

A1R：AATGTGAACAGTTTGAGCGGAGT。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，其特征在于：所述A2對(duì)應(yīng)的特異性引物為A2F：CACTATCTCCTTGCGTTTGTTATG；

A2R：ATAACCAAACGCCAGAAACACTA。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，其特征在于：所述步驟（2）和（3）中的PDA平板培養(yǎng)基的組成為：馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，用水補(bǔ)足體積到1000mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，其特征在于：所述步驟（2）中的試劑盒為Phire?Plant?Direct?PCR?Kit試劑盒。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，其特征在于：所述步驟（3）中的PDA試管培養(yǎng)基的組成為：馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，用水補(bǔ)足體積到1000mL。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，其特征在于：所述步驟（4）中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：

擴(kuò)增體系:2×PCR?buffer?10μL，Phire?Hot?Start?II?DNA?Polymerase0.4μL，10μmol/L草菇菌株檢測(cè)專用引物對(duì)各1μL，菌絲體稀釋液0.5μL，ddH₂O7.1μL；PCR反應(yīng)條件：98℃2min；98℃5s，67℃5s，72℃20s，40個(gè)循環(huán)；72℃10min。