[發明專利]共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶制備門冬氨酸鳥氨酸的方法

無效

• 申請號: 201210575299.4
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103014087A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 高智慧;丁國鈺
• 申請（專利權）人: 天津啟仁醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12P13/20
• 分類號: C12P13/20;C12P13/10;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

1.一種共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶制備門冬氨酸鳥氨酸的方法，其特征在于該方法包括：

首先PCR擴增來源于枯草芽孢桿菌的天門冬氨酸酶基因，采用基因工程方法構建重組表達質粒pET-20b(+)-asp；然后以pET-20b(+)-asp為模板，PCR擴增獲得產物為5’端帶有T7啟動子和rbs序列的天門冬氨酸酶基因，采用基因工程方法，將該基因克隆到pET-24a(+)-arg中，獲得重組質粒pET-24a(+)-arg-asp；將重組表達載體轉化至E.coli?BL21(DE3)，獲得共表達基因工程菌株BL21(DE3)-pET24a(+)-arg-asp，該重組菌體細胞能同時表達有高活性的精氨酸酶和天門冬氨酸酶；

以該重組菌為酶源，在同一個反應體系中，分別催化底物L-精氨酸和延胡索酸銨，其中底物L-精氨酸的用量為0.1至1mol/L，延胡索酸銨的用量為0.1至1mol/L，菌體的添加量為4-6g/L，在30至45℃下，pH8至10，以1mmol/L無水硫酸鎂為輔助因子，經酶法轉化反應4至12h，生成L-鳥氨酸和L-天門冬氨酸，收集轉化液后，通過1萬截留分子量中空纖維素柱去除大分子量雜質及活性炭脫色，最后減壓濃縮，加入3倍體積無水乙醇，冰水浴攪拌冷卻析出，收集沉淀得天門冬氨酸鳥氨酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：酶促反應液中，底物L-精氨酸的用量優選為1mol/L，底物延胡索酸銨的用量優選為1mol/L，菌體細胞的添加量優選為5g/L，優選轉化溫度為37℃，優選轉化pH9，優選轉化時間12h。