[發明專利]一種腫瘤靶向診斷用小肽

有效

• 申請號: 201210572675.4
• 申請日: 2012-12-26
• 公開（公告）號: CN103012561A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 劉敏;王雙坤
• 申請（專利權）人: 劉敏;王雙坤
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12N15/11;A61K38/08;A61K49/14;A61P35/00;G01N33/68
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技術領域

本發明涉及一種多肽，具體而言涉及一種結合FAP的多肽。

背景技術

目前，惡性腫瘤已經逐漸取代心腦血管疾病，成為人類的頭號殺手。最近統計資料表明，我國每年新發現癌癥患者約2000萬人，近150萬人死于癌癥。癌癥的死亡人數占總死亡數的1/5。腫瘤的早期診斷與治療是提高其治愈率及改善病人生存質量的關鍵。

腫瘤的基本特征是細胞的失控性生長，腫瘤細胞自身基因結構及基因表達的改變導致腫瘤的發生發展已被大家廣泛接受是。然而隨著研究的深入，傳統觀念正被改變，腫瘤的發生發展并非由上皮或間質單方面決定，而是由兩者相互作用所構成的腫瘤-宿主界面微環境的平衡狀態所決定[Tlsty?TD，Coussens?LM.Tumor?stroma?and?regulation?of?cancer?development.Annu?Rev?Pathol?2006；1(1)：119-50]。腫瘤微環境調控著腫瘤的多種生物學行為，為腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移等提供了必要的物質基礎。腫瘤相關成纖維細胞(Tumor-associated?fibroblasts)是上述微生態環境中最主要的宿主細胞之一，它通過直接的細胞-細胞接觸、可溶性因子的分泌和對細胞外基質的修飾而對該體系的平衡起著重要的調控作用。腫瘤相關的成纖維細胞占腫瘤組織的50％～90％，主要分布于腫瘤基質內、靠近腫瘤血管內皮細胞并包繞著癌巢[Loeffler?M，Krüger?JA，Niethammer?AG，Reisfeld?RA..R.Targeting?tumor-associated?fibroblasts?improves?cancer?chemotherapy?by?increasing?intratumoral?drug?uptake?J.Clin.Invest，2006(7)，116：1955-1962]。腫瘤相關成纖維細胞是非轉化細胞且基因組非常穩定，與正常組織成纖維細胞差異顯著，并且在各種腫瘤中的差異較小，因而有可能成為腫瘤早期診斷和抗腫瘤治療的新的切入點。

成纖維細胞活化蛋白(Fibroblast?Activation?Protein，FAP)是腫瘤相關成纖維細胞的核心標志物，屬II型膜結合糖蛋白屬于絲氨酸蛋白水解酶家族，在脊椎動物的進化過程中高度保守。且FAP僅選擇性表達于胚胎，間葉組織、上皮組織來源的腫瘤中與腫瘤分級、轉移及預后密切相關。

FAP是腫瘤基質成纖維活化細胞穩定表達的標志分子，是腫瘤靶向診斷的理想靶點，針對FAP設計的小肽分子探針能夠避開腫瘤細胞本身的異質性，從而提高腫瘤診斷靈敏度和特異性，有可能成為腫瘤靶向診斷有前途的通用型探針，為腫瘤的分子成像提供新的思路。本發明擬以FAP為靶點，采用噬菌體肽庫技術篩選FAP高親和力配體小肽，為腫瘤靶向診斷提供一種新的方法。

發明內容

為提高腫瘤診斷靈敏度和特異性問題，本發明提供一種多肽，所述多肽能夠特異性結合FAP，所述多肽其氨基酸序列為SCDSWHYWC。

本發明通過篩選噬菌體展示環七肽庫(Ph.D.-C7CTMPhage?display?peptide?library)，篩選得到對FAP具有高特異性和高親和力的多肽M1，具體篩選方法如下：

以FAP包被免疫試管并封閉，TBST洗滌后加入噬菌體肽庫，振蕩孵育一定時間后，TBST洗滌去除非特異結合的噬菌體，加噬菌體洗脫液振蕩洗脫特異結合的噬菌體，加中和液，取部分洗脫產物計數噬菌體的滴度，其余洗脫產物感染大腸桿菌ER2738擴增并純化噬菌體，得到次級庫。逐步降低FAP包被濃度，再進行兩輪篩選。從第三輪計數平板上隨機挑到若干個菌落，培養、純化得到噬菌體后，通過噬菌體ELISA測定各株噬菌體對FAP的結合。

通過噬菌體ELISA方法，篩選得到25株對FAP結合的噬菌體。對所述25株噬菌體測序，分析測序結果得到有7株多肽序列，將所述多肽序列分別為命名P1-P7。呈現頻率最高的三種多肽共有SCD(xx)H(xx)WC序列；其中多肽序列P1的出現頻率為4/25，其氨基酸序列為SCDSWHYWC，所表達的多肽命名為M1。

將多肽M1合成并用熒光標記，檢測熒光標記的多肽M1與FAP的結合，結果顯示所得熒光標記的多肽M1能夠與FAP特異性結合。所述M1的合成可以為生物方法的表達，也可以是化學方法的合成，所述化學方法優選固相合成方法；所述熒光標記優選FITC(fluorescein?isothiocyanate)標記。