[發(fā)明專利]一種游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210571304.4
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN103063852A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于大為;程曉蕾;李冬冬
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: G01N33/78
• 分類號: G01N33/78;G01N21/76
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 汪青

1.一種游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒，所述試劑盒包括用于免疫反應(yīng)步驟的免疫反應(yīng)試劑，所述的免疫反應(yīng)試劑包括含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液和包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液，其特征在于：所述的免疫反應(yīng)試劑還包括含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液，該堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原由堿性磷酸酶與游離甲狀腺素抗原通過交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯連接構(gòu)成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒，其特征在于：所述的含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液的pH為7~9，其中的熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的濃度為0.5~1μg/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒，其特征在于：所述包被有抗熒光素抗體的磁微粒中，抗熒光素抗體與磁微粒之間相化學(xué)偶聯(lián)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒，其特征在于：所述的含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液的pH為7~9，其中堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的濃度為0.02~0.1μg/mL。

5.一種如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液、所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液以及所述包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的步驟，其特征在于：所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液的制備過程如下：

①?使游離甲狀腺素抗原與交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯在二甲基亞砜溶劑中，在室溫下反應(yīng)，使生成甲狀腺素抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物，于2~8℃下保存?zhèn)溆茫渲校核龅挠坞x甲狀腺素抗原、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg；

②?將含有堿性磷酸酶的緩沖液與步驟①所得溶液按照堿性磷酸酶與甲狀腺素抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物的摩爾比為1:1.1~1.3的比例混合，在室溫下反應(yīng)，使生成所述堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱除鹽，選擇具有適當(dāng)pH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得，其中堿性磷酸酶的緩沖液的濃度為0.5~1.5mg/mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：步驟①中，取游離甲狀腺素抗原，加入二甲基亞砜溶解該抗原至濃度為20~50mg/mL，加入交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯，室溫反應(yīng)2~3小時，用二甲基亞砜將反應(yīng)液1:10稀釋，于2~8℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于：步驟②中，取濃度大于等于5mg/mL的堿性磷酸酶的磷酸鹽緩沖液，用pH?9~10的碳酸氫鈉緩沖液稀釋至0.5~1.5mg/mL，加入步驟①所得反應(yīng)液，室溫靜置反應(yīng)20~60min。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述的含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液的制備方法如下：配制含有熒光素的pH為9~10的緩沖液，然后按照熒光素與抗游離甲狀腺素抗體的分子比為20~200:1的比例，將所述含有熒光素的pH為9~10的緩沖液與抗游離甲狀腺素抗體的pH為9~10的緩沖液混合，混勻后，室溫靜置反應(yīng)，然后將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去游離的熒光素，得到含有熒光素標(biāo)記的抗游離甲狀腺素抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)pH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH，即得。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述的包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的制備方法如下：使含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與抗熒光素抗體在偶聯(lián)劑碳二亞胺的存在下，室溫反應(yīng)2~18小時，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)pH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得，其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為0.5~2μm，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量不低于0.4mmol；所述的抗熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價大于1:100萬。

10.根據(jù)權(quán)利要求5或8或9所述的制備方法，其特征在于：所述的具有適當(dāng)pH值的緩沖液為含有0.5%牛血清白蛋白、pH8.0的TRIS緩沖液。