[發(fā)明專利]一種用于研究醋糟基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總DNA提取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210571281.7
• 申請(qǐng)日: 2012-12-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103045585A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李萍萍;林英;趙青松;杜道林;王紀(jì)章
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 汪旭東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物與生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于研究醋糟無(wú)土栽培基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總DNA提取方法。

背景技術(shù)

微生物是無(wú)土栽培基質(zhì)中非常重要的組成部分，因而對(duì)無(wú)土栽培基質(zhì)中微生物的研究是無(wú)土栽培基質(zhì)研究領(lǐng)域內(nèi)一個(gè)重要的方向，對(duì)于促進(jìn)無(wú)土基質(zhì)栽培的發(fā)展具有十分重要的意義。常用的用于微生物群落研究的方法有：培養(yǎng)分離法、磷脂脂肪酸法和BIOLOG板法等，但是上述方法都有各自的缺陷。培養(yǎng)分離法只適合可培養(yǎng)微生物的研究，由于環(huán)境中的微生物99%以上都是不可培養(yǎng)的，因而傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法大大限制了對(duì)微生物資源的研究。磷脂脂肪酸法所依賴的針對(duì)個(gè)別脂肪酸標(biāo)識(shí)物的細(xì)致描述也是源于少數(shù)可被分離的微生物的純培養(yǎng)。因此，在研究無(wú)法培養(yǎng)的菌群占絕大多數(shù)的微生物群落時(shí)，磷脂脂肪酸法也存在一定的局限性。另外，由于不同菌種相同脂肪酸的相互疊加，磷脂脂肪酸法也難于在種水平上辯明微生物群落的確切組成。不同的微生物對(duì)同一C源的利用能力不同，微生物對(duì)不同單一C源的代謝指紋差異并不能簡(jiǎn)單地歸納為微生物群落數(shù)量和結(jié)構(gòu)的差異，BIOLOG板法也不能準(zhǔn)確的反應(yīng)出環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用16S?(18S)?rRNA/rDNA?序列分析技術(shù)，研究者可以在不對(duì)微生物進(jìn)行純培養(yǎng)的情況下對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行全面的研究，包括微生物的分離鑒定、群落結(jié)構(gòu)和功能的分析。而利用分子生物學(xué)的手段對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行研究，獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的DNA是應(yīng)用16S?(18S)?rRNA/rDNA序列分析技術(shù)進(jìn)行環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)，常用的用于土壤和堆肥DNA提取的方法有：液氮研磨法，SDS-反復(fù)凍融法、玻璃珠吸附法等。

醋糟基質(zhì)是以制醋過(guò)程中產(chǎn)生的殘?jiān)自銥樵希ㄟ^(guò)堆制發(fā)酵形成的新型園藝有機(jī)基質(zhì)，作為草炭的替代基質(zhì)，醋糟基質(zhì)在育苗和栽培中已經(jīng)得到廣泛使用，并投入了商品化生產(chǎn)。但目前對(duì)醋糟無(wú)土栽培基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化尚不清楚。利用16S?(18S)?rRNA/rDNA?序列分析技術(shù)可解決這方面的問(wèn)題。醋糟基質(zhì)作為一種堆肥產(chǎn)品，在堆制發(fā)酵的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的腐殖酸，這些腐殖酸會(huì)對(duì)DNA的提取及PCR擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響。對(duì)腐殖酸的去除，常用的方法有：硫酸鋁捕獲腐殖酸法、氯化銫密度梯度離心法，高效分子量排阻層析，試劑盒純化法。這些純化處理方法增加了復(fù)雜性，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因而尋求一種有效的獲取高質(zhì)量的DNA提取方法是利用分子生物學(xué)手段研究醋糟基質(zhì)栽培過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化所急需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)醋糟基質(zhì)含有大量腐殖酸這一特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)的土壤微生物基因組DNA提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)在DNA提取buffer中添加0.5%?的β-巰基乙醇和0.5%?的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對(duì)醋糟基質(zhì)中的腐殖酸和酚類物質(zhì)進(jìn)行了初步去除。用氯仿:?異戊醇(24:?1/v:?v)?抽提蛋白后，用2%?的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對(duì)DNA中的腐殖酸和酚類物質(zhì)再次進(jìn)行去除。從而建立了一種高效、快速的可用于16S?(18S)?rDNA?PCR擴(kuò)增的高質(zhì)量的醋糟基質(zhì)總DNA提取方法。為利用分子生物學(xué)的手段研究醋糟基質(zhì)中微生物的群落結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于研究醋糟基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總DNA提取方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行：

（1）先在醋糟基質(zhì)中加入DNA提取緩沖液和蛋白酶K，振搖，使醋糟基質(zhì)中的微生物充分懸浮在DNA提取緩沖液中，優(yōu)選DNA提取緩沖液的配方為：10?mM?Tris-Hcl?(pH?8.0)，100?mM?Sodium?EDTA(pH?8.0)，100?mM?Sodium?phosphate?(pH?8.0)，1.5?M?Nacl，?1%?CTAB，0.5%?β-巰基乙醇和0.5%?PVP，優(yōu)選蛋白酶K用量為蛋白酶K的濃度為20?mg/?ml，加入量為12.5?μl；

（2）將步驟(1)制得的懸浮液用十二烷基磺酸鈉裂解醋糟基質(zhì)中的微生物，離心后取上清，優(yōu)選十二烷基磺酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%；

(3)?加入與步驟(2)取得的上清液等體積的氯仿-異戊醇混合液抽提蛋白，其中氯仿:異戊醇體積比=24:?1，離心后取上清；

(4)?加入與步驟(3)取得的上清液等體積的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，去除腐殖酸和酚類物質(zhì)，離心后取上清，優(yōu)選聚乙烯聚吡咯烷酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%；

?(5)?將裝有步驟(4)中取得的上清液的離心管上下輕微的搖動(dòng)，直至離心管中可見(jiàn)絮狀物質(zhì)，將離心管置于-20?℃沉淀?20?min；