[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210570247.8
• 申請(qǐng)日: 2012-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN103060252A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堅(jiān);堵國(guó)成;劉龍;李江華;劉延峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/75;C12P19/26;C12R1/125;C12R1/865
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌工程菌，特別是一種通過(guò)同源重組敲除nagA及nagB提高重組枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

乙酰氨基葡萄糖是生物體內(nèi)的一種單糖，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、霉菌、植物以及動(dòng)物體內(nèi)。在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對(duì)修復(fù)和維持軟骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛作為藥物和營(yíng)養(yǎng)膳食添加來(lái)治療和修復(fù)關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應(yīng)用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，此方法產(chǎn)生的廢液對(duì)環(huán)境污染較為嚴(yán)重，而且得到的產(chǎn)品易引起過(guò)敏反應(yīng)，不適宜海鮮過(guò)敏的人群服用。

枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認(rèn)證為“generally?regarded?as?safe”(GRAS)安全級(jí)別。因此，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌是生產(chǎn)食品安全級(jí)乙酰氨基葡萄糖的有效途徑。然而，乙酰氨基葡萄糖是枯草芽孢桿菌優(yōu)先利用的碳源物質(zhì)，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡后，胞外乙酰氨基葡萄糖被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，通過(guò)脫氨基、脫乙酰作用，以果糖-6-磷酸形式進(jìn)入細(xì)胞糖酵解途徑，參與細(xì)胞代謝。因此，需要敲除乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因（nagB），以阻斷乙酰氨基葡萄糖的降解，提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量。本發(fā)明通過(guò)同源重組敲除乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因（nagB），阻斷宿主菌降解乙酰氨基葡萄糖途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌工程菌，是將釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因GNA1克隆到枯草芽孢桿菌，同時(shí)敲除該枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因nagA、乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB及乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP構(gòu)建而成的枯草芽孢桿菌工程菌。

所述氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因如NCBI-Gene?ID:850529所示；乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因如NCBI-Gene?ID:936621所示；乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB如NCBI-Gene?ID:936619所示；乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP如NCBI-Gene?ID:938807所示。

所述氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因通過(guò)表達(dá)載體pP43NMK進(jìn)行表達(dá)；所述枯草芽孢桿菌為Bacillus?subtilis168。

本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建上述枯草芽孢桿菌工程菌的方法，具體方法如下：

敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因（nagP），阻斷宿主菌從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)乙酰氨基葡萄糖至胞內(nèi)的途徑。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除在已敲除乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因（nagB），阻斷乙酰氨基葡萄糖降解途徑。在已敲除nagP、nagA及nagB的宿主菌內(nèi)，運(yùn)用表達(dá)載體pP43NMK過(guò)量表達(dá)釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因（GNA1），通過(guò)代謝工程改造，實(shí)現(xiàn)乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的提高。

重組枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵：

種子培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。

培養(yǎng)條件：將37℃C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃C、200rpm條件下培養(yǎng)30h。

乙酰氨基葡萄糖的測(cè)定方法：

高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)法：Agilent1200，RID檢測(cè)器，NH₂柱(250×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：70%乙腈，流速0.75mL/min，柱溫30℃C，進(jìn)樣體積為10μL。

本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌可提高乙酰氨基葡萄糖在胞外積累，其濃度可達(dá)到1.23gL，為進(jìn)一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式