[發明專利]檢測α-L-巖藻糖苷酶的液體單試劑及其制備方法

無效

• 申請號: 201210568795.7
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102967571A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 北京利德曼生化股份有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種人體內酶含量的檢測試劑，尤其涉及一種檢測α-L-巖藻糖苷酶的液體單試劑及其制備方法，屬于α-L-巖藻糖苷酶的檢測領域。

背景技術

α-L-巖藻糖苷酶（α-L-Fucosidase，AFU）是一種溶酶體酸性水解酶，分類名為α-L-巖藻糖苷巖藻糖水解酶（EC3.2.1.51）。它主要存在于人體內的各種組織、細胞及體液中，如肝、胰、腦、肺、腎纖維細胞等的溶酶體內，以肝腎含量最高。在血清、尿液、唾液、淚液和垂體液中均含此酶。基本生理功能是催化含巖藻糖基的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖苷的分解代謝。

巖藻糖苷貯積癥患者的腦、肝、腎、肺、尿內都有該酶的缺乏，導致在這些器官內出現異常的沉積物。在腦、肝等組織的沉積物是一種含有巖藻糖的糖脂，主要以巖藻糖為終末部分的四己糖基及五己糖基神經酰胺為主，特別是腦內此特征最為明顯。因此可能這是巖藻糖苷貯積癥的發病機制。本病分幼兒型和成人型，他們有共同的特征如全身肌張力低下、出汗過多、體態短小、進行性智力和運動發育遲緩等。幼兒型一般在一歲左右出現明顯臨床癥狀，多死于10歲以內。

α-L-巖藻糖苷酶升高多見于肝臟受損患者、妊娠與卵巢腫瘤等情況。早在1977年，Bauer等就在動物實驗中觀察到鼠肝癌組織中AFU活力較正常肝臟高7倍，提示AFU可作為一項肝癌非特異性標志物；1980年Deugnier等首先在人肝癌患者血清中發現AFU活性明顯高于正常人，正式為診斷原發性肝癌(PHC)提供了新的指標。肝癌患者血清AFU升高的原因目前暫不清楚，可能機制是：①肝癌細胞合成酶增加并大量釋放入血。②血清AFU破壞減少，正常時肝枯否細胞從血清中清除AFU，推測肝癌患者由于細胞免疫功能低下或其他原因使枯否細胞清除AFU的能力下降，而表現為酶活性升高。③含巖藻糖的糖蛋白和糖脂的代謝紊亂。

目前臨床診斷早期肝癌的主要生化指標是甲胎蛋白（Alpha?Fetal?Protein，AFP），它是胚胎時期肝細胞合成的一種特殊糖蛋白，可促進胚胎肝組織迅速增殖，故胎血中含量高，在胎兒出生后約1～4周基本消失，成人血中含量非常少。當肝癌組織只有0.1～0.2厘米的癌塊時，患者血液中就能檢測到AFP的升高，而此時用B?超、CT、磁共振等的影像學檢查還難以發現。診斷早期肝癌，AFP比影像學檢查要早數月至1?年左右，這能為患者贏得寶貴的治療時間。原發性肝細胞癌中，70～90%?的患者AFP?呈陽性。

臨床上對AFP的檢測均使用免疫的方法，不可避免會有假陽性和假陰性的結果。而作為對早期原發性肝癌診斷的有力補充，AFU具有較大的優勢。國內對24例肝細胞癌患者進行血清AFU和AFP相關研究，發現AFU診斷敏感為87%，特異性為78%，而AFP則分別為65%和89%（診斷界限為，20ug/L）。提示AFU診斷的敏感性好，而特異性較AFP低。

血清AFU的檢測方法有兩大類：熒光法與比色法。熒光法利用AFU水解4-甲基傘型酮α-L-巖藻吡喃糖苷釋放4-甲基傘型酮產生熒光來進行檢測，靈敏度較高，但該法對儀器條件要求高，常規應用有較大困難。比色法中，早期以4-硝基苯α-L-巖藻吡喃糖苷（PNPF）為底物，經AFU水解后釋放4-硝基苯酚（4-NP），反應一定時間后用堿性緩沖液終止反應并使4-NP呈黃色，在規定波長下讀取吸光度A，利用標準曲線或4-NP的摩爾吸光度可以計算出AFU活性。后來以PNPF為底物還發展了速率法的檢測方法，使靈敏度、抗干擾性都有所提高，適用于各種半/全自動分析儀器。但因底物溶解性的問題，需要調節反應pH值為6.1，在這個PH下AFU活性只能達到60%～70%，因此PNPF底物的速率法測值偏低。另外一種以氯化對硝基苯α-L-巖藻吡喃糖苷（CNPF）作底物，靈敏度和精密度較PNP法都有了很大的改善。但大多為干粉試劑，且易受樣本中溶血、黃疸及脂血的干擾。