[發(fā)明專利]一種基于內(nèi)含成分的快速初篩茶樹優(yōu)異資源的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210568497.8
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN103033578A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉碩謙;李娟;黃建安;劉仲華;李銀花;林海燕;田娜
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于經(jīng)濟作物種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于內(nèi)含成分的快速初篩茶樹優(yōu)異資源的方法。

背景技術(shù)

茶葉是中國重要的經(jīng)濟作物和傳統(tǒng)的出口產(chǎn)品，中國茶葉種植面積和年產(chǎn)量均居世界第一位。中國作為茶樹原產(chǎn)地，茶區(qū)地跨暖溫帶、亞熱帶和邊緣熱帶，生態(tài)資源和茶樹種質(zhì)資源豐富，是茶樹遺傳變異的巨大寶藏。據(jù)不完全統(tǒng)計，全國各產(chǎn)茶省/區(qū)收集入圃保存的各類茶樹種質(zhì)資源已達3000余份，而尚未入圃茶樹資源數(shù)目更多。這些?茶樹優(yōu)異種質(zhì)資源是茶樹種質(zhì)創(chuàng)新、品種選育、生產(chǎn)利用的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而如何高效快速地篩選優(yōu)異資源是茶業(yè)界尚未解決的重要問題。

雖然分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展使早期鑒定技術(shù)從形態(tài)、生化水平發(fā)展到分子水平，對縮短育種年限和提高育種效率具有重要、現(xiàn)實的意義。其不僅可以定位目標(biāo)基因，也可利用與目標(biāo)基因緊密連鎖標(biāo)記追蹤目標(biāo)基因，在育種過程早期對目標(biāo)性狀進行分子標(biāo)記輔助選擇。但是由于茶樹遺傳背景復(fù)雜，茶樹分子生物學(xué)研究進展緩慢，目前分子標(biāo)記手段尚未能應(yīng)用于茶樹優(yōu)異種資源的篩選。因此，化學(xué)篩選法仍然是目前茶樹優(yōu)異資源尤其是特異品質(zhì)化學(xué)成分資源篩選的主流手段。

茶葉中富含茶多酚、咖啡堿、氨基酸等內(nèi)含成分。茶葉的色、香、味和茶葉中含有的多酚類化合物有很大的關(guān)系，尤其是色澤和滋味。茶多酚中最主要的是兒茶素類化合物，影響著茶葉的品質(zhì)，與人體的保健功能有重要的關(guān)系。兒茶素類化合物包括很多種兒茶素，最重要的有表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（ECGG）和沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）等幾種，EGCG?的含量占兒茶素總量的50%以上，而EGCG和ECG對人體健康的作用引起特別的關(guān)注。茶葉中咖啡堿具有提神、興奮和降脂減肥的功效，但咖啡堿在茶葉中也存在多種不利影響，因此低咖啡堿茶葉往往深受消費者喜愛。茶葉中的氨基酸與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)，茶葉中的氨基酸總量可達2～4%，尤其是綠茶中茶氨酸的含量更高，占氨基酸總量的50%以上。茶氨酸具有解除疲勞、降低血壓、增效抗癌藥物藥效和預(yù)防人體肝臟損傷的作用。由此可見，茶葉中各種活性成分各自具有其獨特的生理活性，同時也發(fā)揮綜合的協(xié)調(diào)功能和生理調(diào)節(jié)作用。不同品種的茶葉中內(nèi)含成分組成和水平差異較大，這些內(nèi)含成分是茶樹育種者考察的主要指標(biāo)。而對這些指標(biāo)的分析，目前采用的方法是將茶葉經(jīng)干燥，以大量的容積回流提取，過濾獲得檢測樣品，再經(jīng)色譜方法檢測。該方法步驟繁瑣，不僅花費大量時間，而且有機溶劑用量大，提取效率低，且需要的材料量大，樣品需烘干處理。由此可見，經(jīng)典的化學(xué)篩選法方法無法勝任從大量的茶樹資源中篩選出優(yōu)異種質(zhì)。因此，建立快速高通量的茶葉內(nèi)含成分分析方法，快速獲取茶樹新種質(zhì)，是突破當(dāng)前茶樹育種和種質(zhì)創(chuàng)新困境的重要突破口。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡便、快速且適用于高通量分析的基于內(nèi)含成分的快速初篩茶樹優(yōu)異資源的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種基于內(nèi)含成分的快速初篩茶樹優(yōu)異資源的方法，該方法步驟如下：

1）取各茶樹最上端芽頭第一片展開葉，無破損地裝入2mL塑料離心管，蓋上蓋子，對各樣品進行標(biāo)記；取樣時，要求取樣時的茶樹為茶樹資源生長條件及生長勢基本一致、且取樣時間點一致的茶樹；采集的樣品小心放在離心管中，不能破損，可防止因細胞受損導(dǎo)致茶葉內(nèi)含成分發(fā)生化學(xué)或物理變化；且離心管的蓋子要求蓋好，以防樣品失水或風(fēng)干，導(dǎo)致結(jié)果誤差過大；

2）室溫下，對各個樣品進行準(zhǔn)確稱重；

3）蓋緊各樣品的離心管蓋子，于液氮中冷凍30-60s后取出，迅速將葉片搗碎；要求注意液氮不能進入離心管內(nèi)，搗碎葉片時可用玻璃棒搗碎，也可以加入不銹鋼小珠采用振蕩器振碎。

4）于各離心管中分別加入1.5?mL分析純甲醇，蓋緊離心管蓋子，渦旋30s，60-70℃孵育5-10min，再渦旋1-2min，冷卻至室溫，高速離心，得上清液；在加入甲醇時，要先用甲醇將玻璃棒或振蕩鋼珠淋洗，以保證樣品無損失。如當(dāng)天不進行高效液相色譜分析，可將孵育再渦旋、冷卻后的甲醇溶液保存于-20℃直到下次分析，但采集的樣品要求在當(dāng)天提取完畢，也就是需得到本步驟中的孵育再渦旋、冷卻后的甲醇溶液。

所述高速離心時的轉(zhuǎn)速為12000-14000rpm，時間為2-5min。如果沒有高速離心機，也可以使用低速離心機，但離心時間要適當(dāng)延長。低速離心時，根據(jù)儀器的最大轉(zhuǎn)速來確定時間，以使提取液中的不溶物全部沉積到底部為宜。