[發(fā)明專利]用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法、檢測用的試劑盒及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210568389.0
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號(hào): CN103018446A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊致亭;楊金紅;武新清;王愛法;沈孝功;劉濟(jì)寧;丁建華;夏安春
• 申請（專利權(quán)）人: 青島漢唐生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/576
• 分類號(hào): G01N33/576;G01N33/535;G01N33/558
• 代理公司: 濰坊正信專利事務(wù)所 37216
• 代理人: 王偉霞

1.一種用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于：將抗人IgM與抗人IgG分別固定在膜上，加入待檢血清，待檢血清中的甲肝抗體和固定到膜上的抗人IgM與抗人IgG結(jié)合后，加入酶標(biāo)記甲肝抗原溶液，最后加入顯色液顯色顯示結(jié)果；

所述酶標(biāo)記甲肝抗原溶液采用辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原溶液，并采用以下步驟制備：

（1）將1g辣根過氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸鹽緩沖液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至5.0，所得溶液再與115～125mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽混合，室溫振蕩反應(yīng)后，采用0.01M磷酸鹽緩沖液對所得溶液進(jìn)行透析，制得氨基化辣根過氧化物酶溶液；

（2）將步驟（1）制得的溶液配制成1ml、濃度為5～5.2mg/ml的氨基化辣根過氧化物酶溶液，再向所得溶液內(nèi)加入60～85μl交聯(lián)劑，混勻后于室溫下反應(yīng)25～35min；

（3）將所述反應(yīng)物加入截留分子量為10K的超濾管，并對反應(yīng)物進(jìn)行離心處理8～12min，再以0.01M的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶滯留結(jié)合物至1ml，再以同樣離心力離心8～12min，以除去過量的交聯(lián)劑，并再次復(fù)溶滯留物至1ml；

（4）加入800～1000μl濃度為1mg/ml的甲肝抗原溶液，并于室溫下反應(yīng)25～35min；

（5）使步驟（4）制得的溶液通過SephadexG-200層析柱，收集第一峰的產(chǎn)物，即為酶標(biāo)甲肝抗原溶液。

2.如權(quán)利要求1所述的用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述膜為硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜。

3.如權(quán)利要求1所述的用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原所用交聯(lián)劑分子結(jié)構(gòu)如下：

4.如權(quán)利要求1所述的用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述顯色液為包括四甲基聯(lián)苯胺、過氧化脲、抗氧化劑綠原酸、還原劑抗壞血酸、紫外線吸收劑2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸異辛酯和pH5.0的乙酸鈉緩沖溶液體系。

5.如權(quán)利要求4所述的用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述顯色液采用如下方法制得：

⑴將8.3～8.5g三水合乙酸鈉晶體溶于600ml超純水中，振蕩混勻，并調(diào)整溶液pH至5.0；

⑵再將0.4～1.0g四甲基聯(lián)苯胺溶于3ml無水乙醇中，制得四甲基聯(lián)苯胺乙醇溶液；

⑶將上述兩種溶液混合，振蕩混勻；

⑷分別將70～90mg綠原酸與70～90mg抗壞血酸、8～12ml2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸異辛酯、2.5～2.9g磷酰甘氨酸及0.2～0.8g過氧化脲加入到步驟（3）所得到的混合溶液中，振蕩混勻，得到所述顯色液。

6.如權(quán)利要求1所述的用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原使用前，加入酶標(biāo)記物穩(wěn)定性緩沖液，所述酶標(biāo)記物穩(wěn)定性緩沖液采用以下方法制備：

⑴褐藻提取物的制備：新鮮海藻樣品采集后，除去附生生物，用蒸餾水反復(fù)沖洗后取藻體頂部，稱量后用組織搗碎機(jī)破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液除去乙醇，加入磷酸鹽緩沖液，離心后取上清液，即制得褐藻提取物；

⑵酶標(biāo)記物穩(wěn)定性緩沖液的配制：向0.01M的磷酸鹽生理鹽水緩沖液中加入0.02～0.04wt%的甲基異噻唑啉酮與0.04～0.08wt%診斷試劑防腐劑PROCLIN300，然后依次加入2～8wt%海藻糖、0.01～0.07wt%黃原膠、0.9wt%甘氨酸與0.7wt%絲氨酸，混勻后再加入0.3～1.2wt%褐藻提取物、0.1～0.6wt%基因重組的類人膠原蛋白，最后加入1.8wt%的硫酸鎂與0.9wt%氯化鋅、0.1%維生素B1及3%體積比的甘油，混合均勻，得到所述酶標(biāo)記物穩(wěn)定性緩沖液。

7.用于檢測甲型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，包括設(shè)置在所述試劑盒內(nèi)的檢測盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原溶液瓶、洗滌液瓶和顯色液瓶，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原溶液采用如權(quán)利要求1所述方法制備，所述檢測盒包括可以扣合在一起的盒體和盒蓋，所述盒蓋上開有反應(yīng)窗口，所述反應(yīng)窗口處由上至下依次固定設(shè)有包被膜與吸水墊，所述包被膜上包被有兩個(gè)檢測點(diǎn)與質(zhì)控點(diǎn)，所述兩個(gè)檢測點(diǎn)上分別包被有抗人IgM與抗人IgG抗體，所述質(zhì)控點(diǎn)包被有抗甲肝抗體。