[發(fā)明專利]艱難梭菌外毒素A羧基端序列密碼子優(yōu)化基因片段、表達(dá)載體構(gòu)建方法及其表達(dá)蛋白的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210568057.2
• 申請(qǐng)日: 2012-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN103865938A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉紅;馮東曉;邢平平;徐從倫;李敏;郭桂平;于錦麗;趙志偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東國際生物科技園發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/70;C12N15/66;C07K16/12;A61K39/08;A61P31/04
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1.一種密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列，其是將艱難梭菌外毒素A原始序列重復(fù)區(qū)中保守氨基酸序列(conservative?aa?sequence，CAS)的密碼子優(yōu)化為大腸桿菌中使用頻率高的兼并性密碼子，優(yōu)化后的基因序列可在大腸桿菌中表達(dá)，而氨基酸序列不變。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列，根據(jù)同源性分析選取的11個(gè)保守氨基酸序列命名為CAS1-11，其中，CAS1密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.1-5中的任一種序列，CAS2密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.6或SEQ?ID?NO.7，CAS3密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.8或SEQ?ID?NO.9，CAS4密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.10或SEQ?ID?NO.11，CAS5密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.12或SEQ?ID?NO.13，CAS6密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.14或SEQ?ID?NO.15，CAS7密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.16或SEQ?ID?NO.17，CAS8密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.18或SEQ?ID?NO.19，CAS9密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.20-24中的任一種序列，CAS10密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.25或SEQID?NO.26，CAS11密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列選自SEQ?ID?NO.27或SEQ?ID?NO.28。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列，其具有SEQ?ID?NO.29、SEQ?ID?NO.30或SEQ?ID?NO.31所示的核苷酸序列。

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的艱難梭菌外毒素A羧基端基因編碼的蛋白在制備抗艱難梭菌外毒素A抗體中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的艱難梭菌外毒素A羧基端基因編碼的蛋白在制備抗艱難梭菌感染疫苗中的應(yīng)用。

6.一種優(yōu)化多重復(fù)區(qū)基因序列的方法，包括以每個(gè)獨(dú)立重復(fù)區(qū)的保守序列為模塊進(jìn)行多種適應(yīng)于表達(dá)系統(tǒng)的密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的氨基酸序列不變，再將優(yōu)化后的模塊進(jìn)行組合得到多種重復(fù)性低且適于表達(dá)的新基因序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述多重復(fù)區(qū)基因序列為艱難梭菌外毒素A羧基端基因重復(fù)序列。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。

9.一種重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

A)將待表達(dá)的基因分成多段獲得，優(yōu)選兩段，每段基因兩端設(shè)計(jì)合適酶切位點(diǎn)；

B)通過PCR或限制性內(nèi)切酶酶消化的方法獲得與待表達(dá)的基因有對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)的載體。

C)將步驟A中獲得的基因片段及步驟B獲得的載體分別酶切回收后，在DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，獲得含有待表達(dá)基因的重組載體。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述基因片段可人工合成或用其他方法獲得。

11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中待表達(dá)的基因?yàn)槊艽a子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中待表達(dá)的基因?yàn)檫x自權(quán)利要求1-3所述的密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列。