[發明專利]一種高效分離和培養神經元的方法

無效

• 申請號: 201210565969.4
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102994452A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 黃柏勝;鄔力祥;羅奇志;劉發益
• 申請（專利權）人: 黃柏勝
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于動物細胞培養技術領域，具體涉及一種神經元體外分離和培養方法。

研究背景

神經元，又稱神經細胞，是構成神經系統結構和功能的基本單位。神經元是具有長突起的細胞，它由細胞體和細胞突起構成。在長的軸突上套有一層鞘，組成神經纖維，它的末端的細小分支叫做神經末梢。細胞體位于腦、脊髓和神經節中，細胞突起可延伸至全身各器官和組織中。細胞體是細胞含核的部分，其形狀大小有很大差別，直徑約4～120微米。核大而圓，位于細胞中央，染色質少，核仁明顯。細胞質內有斑塊狀的核外染色質（舊稱尼爾小體），還有許多神經元纖維。細胞突起是由細胞體延伸出來的細長部分，又可分為樹突和軸突。每個神經元可以有一或多個樹突，可以接受刺激并將興奮傳入細胞體。每個神經元只有一個軸突，可以把興奮從胞體傳送到另一個神經元或其他組織，如肌肉或腺體。

在神經系統發育過程中，中樞神經系統經歷了細胞數量和體積的增長及細胞連接形成改變過程。分化的神經元一經產生，便不可能再進行分裂，神經元的正常分化過程一旦受損，?即有可能影響突觸聯系的正常建立等一系列過程。對神經元損傷的機制及其防治，一直是人們感興趣的問題。隨著對神經元功能的了解，它已逐漸成為神經生物學領域研究的熱點。但由于在體內神經元與其它神經細胞以及其他組織細胞混雜存在，妨礙了其生物學功能的研究及應用。因此需要對神經元進行體外培養并純化，才能深入了解其形態結構和生物學功能。

由于神經元是一種高度分化的細胞，動物出生后很少分裂增殖，相對于其它細胞而言，神經元在體外更難以存活和生長，其胞體伸出許多又長又細的突起，在取材過程中容易損傷其突起。在胚胎發育過程中，神經系統發育較早。出生后，神經系統發育基本完成，很多神經元此時已經長出突起，取材于該時期的腦組織對神經元的損傷較大。胚胎時期的神經元分化程度較低，體外生存能力強，該時期神經元之間的聯系較少，取材過程中造成的不可逆傷害較小，易于成功培養。

體外培養神經元要求的培養方法和營養條件均較為特殊。目前神經元的培養分為有血清培養和無血清培養，有血清培養提供細胞培養所必須的營養成分，促進細胞增殖和DNA?的合成，但也為神經膠質細胞、成纖維細胞、神經干細胞等其它神經細胞提供了豐富的營養，但也使得培養的神經元很難分離開。無血清培養技術不利于有絲分裂細胞的生長，可防止非神經元過度增殖，可提高培養的神經元純度。采用無血清培養能通過添加某些成分，而且可選擇性地促進和控制神經元的生長。

目前尚未見有關神經元體外分離或培養方法的專利文獻公開，雖然神經元采用常規細胞培養技術，能夠在一定程度上達到培養的目的，但存在著與神經膠質細胞，成纖維細胞等其它雜細胞很難分離以及體外培養存活困難等問題，不能滿足細胞實驗的要求。本室參照國內外培養分離神經元的方法。根據多年的實驗研究，改進了大腦皮質神經元的體外培養方法，建立了一種穩定、可靠的獲得神經元的方法，為了解神經元的結構與功能，闡明其在腦血管疾病、神經系統疾病中的作用研究提供成功的實驗模型。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術存在的問題，改進當前體外分離和培養神經元的方法，使之簡單易行，培養獲得的神經元生長良好，純度高，產量大，可滿足神經科學研究中細胞生物學實驗的需求。

采用以下方案來實現本發明的目的。一種體外分離和培養神經元的方法，含有大腦皮質組織分離、組織細胞搗碎后胰酶消化、篩網過濾離心、細胞原代培養等4個實驗步驟。此外還可包含神經元鑒定的步驟。

大腦皮質組織分離

孕鼠頸椎脫臼致死，無菌條件下取出胚胎，然后在無菌條件下取胎鼠兩側大腦半球放入培養皿中，剝離并去除皮層血管組織和軟腦膜。

優選方案為：孕15-17天的大鼠頸椎脫臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪開腹部至兩側，無菌條件下取出串珠狀胚胎，放入盛有1×PBS的培養皿中，然后在無菌超凈臺內冰床上取胎鼠兩側大腦半球放入盛有1×PBS的培養皿中，用眼科鑷夾取動物雙側大腦皮質置于盛有1×PBS的培養皿內，仔細剝離并去除皮層血管組織和軟腦膜，再將大腦皮質移至另一個盛有1×PBS的培養皿內。