[發(fā)明專利]一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210563626.4
• 申請日: 2012-12-22
• 公開（公告）號: CN103045675A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 龔國利;劉麗麗;王娜
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西科技大學(xué)
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N11/14;C12R1/01
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 汪人和

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于纖維堆囊菌發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法。

背景技術(shù)

埃博霉素B（Epothilone?B，EPO-906）是由纖維堆囊菌產(chǎn)生的一種已進入臨床抗腫瘤治療研究的藥物。目前埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量很低，主要由兩個原因。第一是埃博霉素對其生產(chǎn)菌株有毒性抑制作用，這在很大程度上限制了埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。雖然可以利用大孔吸附樹脂XAD-16來解決這方面的困難，但樹脂對發(fā)酵液中其他物質(zhì)的非特異性吸附也為埃博霉素產(chǎn)量的提高帶來新的困難。第二，纖維堆囊菌復(fù)雜的細胞行為。它們往往在固體培養(yǎng)基上能良好的生長、代謝并產(chǎn)生埃博霉素，但在液體培養(yǎng)基中生長時代謝行為往往會發(fā)生改變；如細胞成團生長，并且內(nèi)外細胞的狀態(tài)不一致；細胞存在自溶性現(xiàn)象；代謝狀態(tài)不穩(wěn)定等。因此開發(fā)一種能夠作為埃博霉素生產(chǎn)菌株的固體化材料，并將其用于發(fā)酵液中將極大地增加埃博霉素的產(chǎn)量。

多孔陶瓷作為一種新型陶瓷材料，一直倍受生物、環(huán)保領(lǐng)域科研人員的青睞，這是因為它作為生物催化劑的載體具有氣孔率高、化學(xué)穩(wěn)定性好、比表面積大、體積密度小以及耐高溫、耐腐蝕等特點，另外多孔陶瓷還具備無毒害作用、穩(wěn)定性優(yōu)異、傳質(zhì)性能好、機械強度高、生物親合性好、操作簡單、價廉易得等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，為纖維堆囊菌生產(chǎn)埃博霉素B提供生長代謝的固體附著面，從而提高發(fā)酵產(chǎn)量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產(chǎn)成本。

為達到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，包括以下步驟：

1）將纖維堆囊菌接種于M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的菌體接種于M26液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；

2）將經(jīng)M26液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的液體，高速攪拌使菌體均勻打散后，離心收集沉淀，加入無菌水重懸得纖維堆囊菌到菌懸液；

3）按100mL發(fā)酵液接種5～10mg菌種的比例，將纖維堆囊菌菌懸液接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質(zhì)量50～400倍經(jīng)發(fā)酵液浸泡處理過的硅藻土基多孔陶瓷材料塊，在25～35℃，180～220rpm搖床培養(yǎng)72～96h。

所述在溫度28～30℃，轉(zhuǎn)速180～200r/min下?lián)u床培養(yǎng)72～96h。

所述的纖維堆囊菌為纖維堆囊菌ATCC25532。

所述在M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為：30℃下，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96h；

所述在M26液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為：30℃，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)72～96h。

步驟2）所述的高速攪拌時間為10～20min。

步驟2）和步驟3）所述的離心過程是在4℃下，8000rpm，離心10min。

所述的多孔陶瓷的孔徑在5～10μm，比表面積為40～50m²/g，能夠吸附固定粘細菌。

所述的多孔陶瓷抗折強度為15～20MPa，吸水率達到50%。

所述的多孔陶瓷的處理為：

多孔陶瓷塊經(jīng)150℃高溫滅菌10～30min，自然冷卻后，加入發(fā)酵液完全覆蓋多孔陶瓷塊并高出10～50mm，常溫下?lián)u晃0.5～1h，靜置1～2h后傾去發(fā)酵液，100～105℃干燥后待用。

所述的多孔陶瓷塊在發(fā)酵時懸浮在發(fā)酵液中。

所述的100mL發(fā)酵液中多孔陶瓷塊的加入量為1～2g。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，在埃博霉素B發(fā)酵生產(chǎn)時，通過添加硅藻土基多孔陶瓷對生產(chǎn)菌株纖維堆囊菌提供附著物，幫助其在培養(yǎng)液中固定，這樣可以為在液體環(huán)境中生長的粘細菌細胞提供一個固體附著面，從一定程度上滿足粘細菌生長代謝產(chǎn)生埃博霉素的固體培養(yǎng)微環(huán)境，克服游離發(fā)酵培養(yǎng)時成團成片生長所帶來的傳質(zhì)不均勻、代謝不穩(wěn)定等難題。

進一步，本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，埃博霉素生產(chǎn)菌株被硅藻土基多孔陶瓷固定，也有利于緩解埃博霉素對其生產(chǎn)菌株的反饋抑制作用，從而提高發(fā)酵產(chǎn)量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產(chǎn)成本，