[發明專利]靶向TLR2的shRNA干擾載體PLK0.1-TLR2-shRNA構建及鑒定

在審

• 申請號: 201210563603.3
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103882059A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 鄭麗麗;楊艷菊
• 申請（專利權）人: 蘇州中同生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其一種靶向TLR2的shRNA干擾載體PLKO.1-TLR2-shRNA構建及鑒定。?

背景技術

一直以來，人們對于天然免疫及其炎癥反應的信號通路尚未完全闡明，近年來，隨著果蠅Toll蛋白的發現，人們發現在哺乳動物和人類也存在著一類與果蠅Toll蛋白相似的跨膜蛋白，即Toll樣受體(toll-like?receptor，TLRs)，在免疫及炎癥反應的信號傳導中扮演重要的角色。TLR2在細胞膜上表達，分別涉及革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌細胞壁成分的識別。TLR2能夠識別革蘭氏陽性細菌壁成份脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)，肽聚糖和脂肽。TLR2在識別病原微生物、產生促炎細胞因子和啟動宿主炎癥反應中發揮著重要的作用。在應對外來病原微生物分子的過程中，TLRs介導的細胞內信號傳遞導致促炎細胞因子基因的表達。由于TLRs是識別外來入侵病原微生物和活化宿主天然免疫系統的主要成份，TLR2表達和信號傳遞的變化不僅在膿毒血癥而且在外科應激的發病機理中也發揮著重要的作用。?

最近的研究表明，TLRs在通過上調巨噬細胞的吞噬活力和促進細菌的清除中發揮重要的作用。在微生物病原體的吞噬過程中，表面的TLR2被募集到吞噬體并被微生物細胞壁成分活化。更最近的研究發現，TLR2參與小膠質細胞(一種明確位于大腦的吞噬細胞)對淀粉樣蛋白β的吞噬過程和巨噬細胞對真菌的吞噬過程，TLR4與腸細胞的吞噬作用有關。這些結果提示TLR2不僅參與宿主炎?癥反應的調節，同時也參與調控細胞介導的吞噬作用。?

本研究通過構建靶向TLR2的shRNA干擾載體PLKO.1-TLR2-shRNA，并篩選出最佳抑制效率的干擾載體PLKO.1-TLR2-S3，為進一步研究探討TLR2參與宿主炎癥疾病的發病機制和防治具有重要意義。?

發明內容

本發明提供一種靶向TLR2的shRNA干擾載體PLKO.1-TLR2-shRNA構建及鑒定方法。?

靶向TLR2的shRNA干擾載體PLKO.1-TLR2-shRNA構建及鑒定，其步驟為：?

1)根據Gene?Bank中TLR2的cDNA序列，參考shRNA設計原則，選擇cDNA序列上的四個部位作為目標序列，同時將選中的shRNA中的堿基序列隨機打亂設計為陰性對照，對照序列經BLAST檢測證實與TLR2mRNA及其他基因編碼序列無同源性；?

2)設計shRNA模板、正義鏈模板、反義鏈模板三條序列，并將設計好的序列送上海生工生物技術有限公司合成；?

3)靶向TLR2的shRNA干擾載體PLKO.1-TLR2-shRNA構建及鑒定，用限制性內切酶AgeI、EcoRI酶切PLKO.1，連接退火片斷和載體，轉化，涂板，挑克隆，小抽質粒，并將克隆送上海英駿生物技術有限公司測序鑒定；?

4)選取有高表達TLR2的細胞株，將構建好的穿梭質粒瞬轉，37℃，5％CO₂孵箱中孵育72小時后，收集細胞分別用蛋白裂解液及Trizol裂解細胞提取總蛋白及總RNA，進行Western?blot分析鑒定。?本發明的優點：?

1)根據Gene?Bank中TLR2的cDNA序列，參考shRNA設計原則，選擇cDNA序列上的四個部位作為目標序列，同時將選中的shRNA中的堿基序列隨機打亂設計為陰性對照，對照序列經BLAST檢測證實與TLR2mRNA及其他基因編碼序列無同源性。?

2)針對目的基因我們設計三對shRNA序列，構建了三個重組慢病毒表達載體，并將這些重組載體包裝病毒后感染大鼠血管平滑肌細胞，采用Western?blot法驗證重組慢病毒對靶基因的抑制效率。實驗結果顯示shRNA-3具有較高的抑制效率，而shRNA-1對靶基因無抑制作用，shRNA-2對靶基因抑制效率較低，可能由于這些shRNA序列不能在細胞內表達或者其產物不能有效結合靶基因所致。?

3)我們選擇抑制效率高的shRNA-3進行后續研究，為進一步研究JAK-STAT3信號通路在血管平滑肌細胞增殖、凋亡等作用奠定了基礎，為抑制血管平滑肌細胞增殖的基因治療提供了新的思路?

具體實施方式

下面結合具體具體實施實例，對本發明進一步說明，但發明的保護范圍并不限于此。?