[發明專利]含有結合雌激素的提取物及其提取純化方法

有效

• 申請號: 201210562681.1
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN103040866A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 孟彩云;秦玉峰;尤金花;周祥山
• 申請（專利權）人: 山東東阿阿膠股份有限公司
• 主分類號: A61K35/22
• 分類號: A61K35/22;A61K31/566;A61K31/565;A61P5/30;B01D15/10
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;丁金玲

技術領域

本發明涉及一種含有結合雌激素的提取物及其提取純化方法，特別是涉及一種從孕驢尿中提取的含有結合雌激素的提取物及提取純化方法。

背景技術

結合雌激素類藥物主要用于激素替代療法（Hormone?Replacement?Therapy，HRT），用于緩解任何雌激素不足的臨床癥狀，治療和預防女性生理或人工絕經后出現的更年期綜合癥，能夠預防和治療骨質疏松癥和冠心病。許多婦女把結合雌激素看作是一種能延緩衰老，留住青春的“靈丹妙藥”，美國惠氏公司也因此開始了在世界范圍內對雌激素產品長達65年的壟斷。

早期結合態雌激素提取研究中主要采用有機溶劑萃取方法，如低碳醇、酯、鹵代烴等，有美國專利US2834712、US2429398、US2711988、US2519516，但該方法易產生乳化、沉淀現象，導致萃取效率低，雌激素損失過多等問題。上世紀60年代，美國專利US2551205開始采用活性炭提取結合雌激素混合物，之后相繼出現了離子交換樹脂、聚丙烯酸酯吸附樹脂、反相硅膠進行提取的案例。但這些方法普遍存在再生困難，吸附效率低，工業成本高等特點。在近幾年關于結合態雌激素的提取研究中，應用新型的大孔吸附樹脂從孕馬尿中提取雌激素的方法逐漸顯露出前所未有的優勢。該方法成本低、樹脂可再生、吸附效率高，易于工業化生產。

孕馬尿中富含雌激素，每升孕馬尿中雌激素的平均含量為70~130mg，每匹孕馬在孕期內可形成雌激素50～100g。目前市售的結合雌激素藥物多為從孕馬尿中提取的天然雌激素。驢和馬同屬馬屬，有著共同的起源，有不少共同特征。但從驢尿中提取含有結合態雌激素的提取物還未見有報道。本發明在現有技術基礎上，采用苯乙烯型非極性共聚體D101大孔吸附樹脂對孕驢尿中結合態雌激素進行吸附分離，并開創性的結合反相柱純化工藝，成功從孕驢尿中提取到結合態雌激素混合物，填補了孕驢尿應用的空白。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種從孕驢尿中提取純化結合態雌激素的方法及由此方法得到的含有結合雌激素的提取物。

為達上述目的，本發明一種從孕驢尿中提取純化結合雌激素的方法，包括以下步驟：

（1）將采集的孕驢尿樣品經過大孔樹脂吸附柱分離，采用水混溶性溶劑進行梯度洗脫，得到含有結合態雌激素的濃縮液；

（2）將提取的結合態雌激素濃縮液，經反相C18柱富集純化，進行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫、收集組分濃縮，得到純化的結合態雌激素混合物；

（3）將純化的結合態雌激素混合物，加水和醋酸緩沖液，震蕩，然后加酶進行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游離雌激素混合物。

本發明的方法，其中優選所述步驟（1）所用的大孔吸附樹脂為苯乙烯型非極性共聚體D101大孔吸附樹脂，市場有售。

本發明的方法，其中優選所述步驟（2）所用純化方法為反相C18柱分離純化，且上樣前，C18反相柱經洗脫溶劑沖洗，預先平衡直到獲得穩定的基線。

本發明的方法，其中優選所述步驟（3）醋酸緩沖液濃度為0.2M，pH=5.2。

本發明的方法，其中優選所述步驟（3）中所用酶為硫酸酯酶。

本發明的方法，其中優選所述水混溶性洗脫溶劑選自低級鏈烷醇，更優選為甲醇或乙醇。

本發明的方法，其中優選所述步驟（1）中的孕驢尿為孕期在3個月到10個月之間的孕驢尿液。

本發明還涉及由上述方法得到的含有結合雌激素的提取物。

進一步地，本發明含有結合雌激素的提取物中三種主要結合態雌激素為雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雌二醇硫酸鈉。

本發明與現有技術不同之處在于，相比之前結合態雌激素多從孕馬尿中提取，本發明首次從孕驢尿中提取結合態雌激素，得到了含有雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雌二醇硫酸鈉三種結合態雌激素的混合物。本發明在現有技術基礎上，采用市售苯乙烯型非極性共聚體D101大孔吸附樹脂進行吸附分離，再經C18反相柱純化、進行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫，從孕驢尿中得到結合態雌激素提取物，由于常規使用的液-液和固-液提取方法中出現的諸多問題，如乳化層形成、沉淀、再生困難等現象，導致提取過程損失嚴重、成本增加、效率低。本發明克服了上述方法所產生的弊端，采用大孔吸附樹脂方法實現了快速、簡便地從孕驢尿中獲得富集的結合雌激素混合物成分，并開創性的結合反相柱分離對富集的結合雌激素混合物進行了純化，得到的提取產品中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雌二醇硫酸鈉成分含量高。本發明工藝簡單，樹脂可再生，節約成本，產品收率高，易于工業化生產。

具體實施方式