[發明專利]一種耐熱β-1，4-內切木聚糖酶(SyXyn11)基因的異源表達

無效

• 申請號: 201210562517.0
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103014040A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;陸源;張慧敏;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/81;C12Q1/34;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種源自細菌的耐熱β-1，4-內切木聚糖酶(SyXyn11)的優化基因，其完整mRNA的核苷酸序列對應于序列表中的SEQ?ID?NO：1。

2.這種源自細菌的耐熱β-1，4-內切木聚糖酶(SyXyn11)，基因優化后其氨基酸序列對應于序列表中的SEQ?ID?NO：2。

3.所述的Syxyn11完整的異源表達、活性測定及分析和酶學性質分析方法：

(1)重組質粒pUCm-T-Syxyn11的構建：根據密碼子的偏愛性，宿主細胞能夠以不同的速度合成蛋白質；編碼蛋白質的基因中有些密碼子對應的tRNA含量少(即屬于稀有密碼子)，所以合成量較少，宿主以此來控制蛋白質的合成速度；因此按照密碼子的偏好性，對外源蛋白編碼基因進行密碼子優化可以有效提高外源蛋白的表達量；為實現來源于細菌的耐熱木聚糖酶基因Evxyn11^TS在P.pastoris中的高表達，對Evxyn11^TS成熟肽基因序列(585bp)進行分析，發現其密碼子的偏好性與畢赤酵母有很大差異；遂對照畢赤酵母密碼子偏好性表對Evxyn11^TS中的稀有密碼子進行優化，并在基因兩端分別加入EcoR?I、Not?I位點，該基因命名為Syxyn11，人工合成后克隆至pUCm-T質粒，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質粒pUCm-T-Syxyn11；

(2)重組表達質粒的構建：將上述得到的重組質粒pUCm-T-Syxyn11進行EcoR?I和NotI雙酶切，割膠回收約600bp的目的基因Syxyn11，與經同樣雙酶切的質粒pPIC9K連接，轉化E.coli?DH5α感受態細胞，經通用引物(5′-AOX和3′-AOX)PCR篩選鑒定后，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質粒pPIC9K-Syxyn11；

(3)Syxyn11在P.pastoris中的表達：pPIC9K-Syxyn11經Sal?I線性化后，用電穿孔法將其導入P.pastoris?GS115中，涂布于MD平板上篩選重組畢赤酵母；在MD平板上將生長良好的菌落用牙簽點種至含不同濃度G418的YPD平板上篩選抗高濃度G418(2.0mg/mL)的重組畢赤酵母，命名為GS115/Syxyn11；同時電轉pPIC9K至P.pastoris?GS115做對照，并命名為GS115/9K；參照《分子克隆實驗指南》中的方法提取重組子的基因組DNA；以此為模板，利用通用引物5′-AOX和3′-AOX進行PCR驗證；耐熱木聚糖酶基因Syxyn11的常規誘導表達參見Multi-Copy?Pichia?Expression?Kit(Invitrogen公司)操作手冊；

(4)木聚糖酶的活性測定及分析：木聚糖酶酶活測定采用改良的DNS試劑法，用櫸木木聚糖作為底物，其中酶反應溫度設定為65℃，以在測定的條件下，每分鐘釋放1μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活單位(U)；蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍染色法(Bradford法)，以牛血清白蛋白為標準；并采用SDS-PAGE對表達產物進行分析及表觀分子量的測定；

(5)重組木聚糖酶酶學性質分析：酶的最適反應溫度及熱穩定性：取適當稀釋酶液于55～95℃水浴條件下進行酶解反應，每隔5℃，分別測定酶活，以酶活力最高者為100％，作溫度-相對酶活性曲線；將酶液于不同溫度下保溫不同時間后，按常規方法測定殘余酶活性，以0min時取出的酶液的酶活性為100％，作溫度-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到85％以上，即定義為穩定；

酶的最適pH及pH穩定性：65℃下，分別測定木聚糖酶在不同pH值下的酶活性；以酶活力最高者為100％，作pH-相對酶活性曲線；將酶在不同的pH值條件下于40℃保溫1h，再分別測定殘留酶活性，以酶活力最高者為100％，作pH-相對酶活性曲線；當殘余酶活達到85％以上，即定義為穩定；反應所用的緩沖液為：0.1mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH3.5～8.0)和0.05mol/L甘氨酸-氫氧化納緩沖液(pH?8.5～9.5)；

金屬離子對酶活性的影響：將不同金屬離子溶液與酶液混合，至終濃度為2mmol/L，40℃保溫1h，然后按常規方法測定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性定義為100％，殘余酶活與其的比值為相對酶活。